Isolamento de Neonatal extra-hepáticas cholangiocytes

Resumo

Uma técnica para isolar cholangiocytes das vias biliares extra-hepáticos de ratos neonatais é descrito. As condutas são meticulosamente dissecados, e, em seguida, as células são isoladas por crescimento em géis de colagénio espessas. Este método fornece uma ferramenta útil para estudar o desenvolvimento do ducto biliar extra-hepática e patologia.

Resumo

Os ductos biliares intra e extra-hepáticos do fígado são developmentally distinta, e podem ser diferencialmente afectada por certas doenças. No entanto, as diferenças entre intra e extra-hepáticos cholangiocytes, e entre as células recém-nascidos e adultos, não são bem compreendidos.

Os métodos para o isolamento de cholangiocytes de ductos biliares são bem estabelecida ^1-4. Isolamento de células ductais extra-hepáticos, particularmente a partir do neonato, ainda não foi descrito, embora este seria de grande benefício para a compreensão das diferenças entre as populações distintas cholangiocyte e no estudo de doenças tais como a atresia biliar que aparecem para atingir os canais extra-hepáticos. Descrito aqui é uma técnica otimizada para isolar as células dos ductos biliares extra-hepáticas, tanto neonatal e adulto do rato. Esta técnica produz uma população de células pura com contaminação mínima entre as células mesenquimais como fibroblastos.

Este metodod é baseado na remoção dos ductos extra-hepáticos e da vesícula biliar, seguida por dissecação meticulosa e raspagem para remover as camadas de gordura e de fibroblastos. As estruturas são incorporados em camadas de espessura de colagénio e cultivadas durante aproximadamente 3 semanas para permitir o crescimento de cholangiocytes em monocamadas, que pode, então, ser tratadas com tripsina e re-plaqueadas para o uso experimental.

Introdução

A origem eo desenvolvimento da intra e extra-hepáticos cholangiocytes são marcadamente diferentes. O fígado se desenvolve a partir de um divertículo do intestino anterior endoderme ventral ^5. A região caudal do divertículo forma a árvore biliar extra-hepática, enquanto que a região craniana gera a árvore biliar intra-hepática ^5. Cholangiocytes duto intra-hepática são derivadas de células progenitoras em torno da placa ductal nas regiões peri portal ^6. Estas células têm a capacidade de se diferenciar em qualquer hepatócitos ou cholangiocytes ^6. Isto tem implicações clínicas significativas, dado que cholangiopathies podem obj....

Protocolo

Todo o procedimento é realizado à temperatura ambiente, a menos que especificado de outra forma. Todo o trabalho animal deve ser realizado em condições humanas no âmbito de um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional locais Animal Care e Use (IACUC).

1. Preparação de equipamentos e soluções

1. Configure mesa cirúrgica o mouse em estreita proximidade com a capa de cultura de tecidos e incubadora (Figura 1A). Nota: Equipamento necessário inclui um microscópio de dissecação, uma fonte de luz, 12,5 cm de comprimento tesoura de íris reta, pinça curva de 6 polegadas não serrilhadas com pontas finas e 4 de polegada d....

Resultados

A utilização destes resultados do protocolo para o isolamento de uma população de rato cholangiocytes extra-hepáticos neonatais com uma pureza excelente, como demonstrado por coloração de imunofluorescência K19 (Figuras 2A e 2B); se conseguir resultados semelhantes isolamento de células a partir de ratinhos adultos. Temos observado que leva 3 semanas para as células dos ductos biliares recém-isoladas para formar monocamadas em géis de colágeno de espessura. Os cholangiocytes crescer de forma linear ao l.......

Discussão

Descrito aqui é uma técnica para isolar cholangiocytes puros das vias biliares extra-hepáticas de ratos de ratos de todas as idades, incluindo recém-nascidos. A técnica oferece a vantagem de que cholangiocytes extra-hepáticas podem ser estudadas separadamente cholangiocytes intra-hepática, e pode facilitar a estudos para identificar as principais diferenças entre estas populações de células. Publicamos recentemente um estudo demonstrando diminuição cílios em cholangiocytes extra-hepáticos isolados por este método e infe.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM/F12 (1:1)	Gibco/ Life technologies	11320-033	500 ml, usado em meio BEC
	FBS Atlanta Biologicals	S11150	25 ml, usado em meio BEC
MEM com aminoácidos não essenciais	Gibco/ Life technologies	11140-019	5 ml, usado em meio BEC
Insulina-transferrina-selênio	Gibco/ Life technologies	51300-044	5 ml, usado em meio BEC
Na Pyruvate	Cellgro	25-000-CL	5 ml, usado em meio BEC
Concentrado lipídico quimicamente definido	Gibco/ Life technologies	11905-031	5 ml, usado em meio BEC
Penicilina-Estreptomicina	Cellgro	30-002-CI	5 ml, usado em meio BEC e 500 μ l no isolamento
Gentamicin	Gibco/ Life technologies	15750-060	0,2 ml, usado em meio BEC e 500 μ l no isolamento
Etanolamina	Sigma Aldrich	E9508-100ml	0,13 ml, usado em meio BEC
MEM solução vitamínica	Gibco/ Life technologies	11120-052	5 ml, usado em meio BEC
Inibidor de tripsina de soja	Biowhittaker	17-605E	5 ml, usado em meio BEC. O solvente é PBS, misture a 5 mg / ml de concentração estoque
L-glutamina	Cellgro	25-005-CL	5 ml, usado em meio BEC
Extrato de hipófise bovina	Gemini	500-102	1,1 ml, usado em meio BEC
Dexametasona	Sigma Aldrich	D4902	0,5 ml, usado em meio BEC, Stock conc 393 &# 956; g/ml diluir com etanol
3 3',5-triiodo-L-tironina	Sigma Aldrich	T6397	0,5 ml, usado em meio BEC, Estoque conc 3,4 mg/ml diluído com etanol
Fator de crescimento epidérmico	Millipore	01-101	0,5 ml, usado em meio BEC, 25 μ g/ml diluir com DMEM F12+1%BSA
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886	5 ml, utilizado em meio BEC, utilizar na concentração estoque de 0,411 mg/ml e diluir com DMSO
Fungizone	Gibco/ Life technologies	15290-018	1 ml, utilizado em meio BEC e 500 μ l no isolamento
Colágeno de cauda de rato	BD Biosciences	354236	variável dependendo da concentração de colágeno
PBS 10x	USB Corporation	75889	uso em 10x, esterlina, usada para fazer colágeno, a quantidade usada depende da concentração
de colágeno dH2O	N/A	N/A	estéril, usado para fazer colágeno, a quantidade usada depende da concentração de colágeno
NaOH 10	N Fischer Scientific	ss255-1	Diluir a 1 N, estéril, usado para fazer colágeno, a quantidade usada depende da concentração de colágeno
colagenase tipo XI de Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C7657	diluir em DMEM e filtro estéril antes de usar
tripsina-EDTA (1x) 0,25%	Gibco / Life technologies	25200-056	3 ml, incubar max 10 min
tripsina-EDTA (10x) 0,5%	Gibco/ Life technologies	15400-054	3 ml, incubar no máximo 10 min
Microscópio de dissecação	Nikon	SMZ645	Outros modelos aceitáveis
Fonte de luz (iluminador de fibra óptica)	Schott-Fostec	Ace EKE LR 92240	Outros modelos aceitáveis
Tesoura de íris reta de 12,5 cm	Kent Scientific		Outros modelos aceitáveis
Pinça curva não serrilhada de 6" com pontas finas	Microscopia Eletrônica Ciências		Outros modelos aceitáveis
4" pinça de aço inoxidável serrilhada com pontas finas	Microscopia Eletrônica Ciências		Outros modelos aceitáveis