संयुक्त डीएनए शाही सेना फ्लोरिसेंट<em> सीटू</em> संकरण (मछली) विभेदित महिला माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता अध्ययन करने के लिए
Summary
सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के भीतर उनके पैतृक वातावरण में न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए अनुमति देता है. हम यहाँ माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो मछली के माध्यम से शाही सेना और डीएनए के संयुक्त, एक साथ पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने में सक्षम बनाता है, जो एक आणविक तकनीक है. डीएनए मछली अक्सर कोशिकाजननप्रकरण और कैंसर निदान में प्रयोग किया जाता है, और अक्सर महत्वपूर्ण नैदानिक निहितार्थ हैं जो जीनोम के aberrations पता लगा सकते हैं. शाही सेना मछली कोशिकाओं में शाही सेना अणु का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और जीन अभिव्यक्ति के नियमन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है. डीएनए मछली के लिए उपयुक्त स्थितियां नाजुक, एकल असहाय शाही सेना अणु के लिए भी कठोर हो सकता है के रूप में एक ही कोशिका के भीतर डीएनए और आरएनए मछली का मेल है, तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है. हम यहाँ एक्स क्रोमोसोम द्वारा इनकोडिंग Xist आरएनए और डीएनए के संयुक्त, एक साथ पता लगाने में सक्षम बनाता है, जो एक आसानी से लागू प्रोटोकॉल उपस्थित थे. इस संयुक्त डीएनए शाही सेना मछली प्रोटोकॉल संभावना आरएनए और डीएनए दोनों का पता लगाया जा करने की जरूरत है, जहां अन्य प्रणालियों के लिए लागू किया जा सकता है.
Introduction
सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट के माध्यम से कोशिकाओं और ऊतकों का अध्ययन कर 1970 के दशक 1 में अपनी शुरुआत के बाद से, शोधकर्ताओं subcellular स्तर पर जीनों chromatin संगठन और जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने की अनुमति दी है. डीएनए मछली अक्सर कोशिकाजननप्रकरण, karyotyping 2, कैंसर निदान 3 और पूर्व आरोपण आनुवंशिक स्क्रीनिंग 4 में प्रयोग किया जाता है, और यह उनके पैतृक वातावरण में न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए अनुमति देता है के बाद से आणविक अनुसंधान 5-6 करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका है. शाही सेना मछली द्वारा एकल कक्ष अभिव्यक्ति विश्लेषण देशी प्राथमिक टेप का पता लगा सकते हैं और noncoding RNAs क्रोमोसोम से लिखित जा रहा है, और उदाहरण के लिए सहित एक जनसंख्या स्तर पर जीन अभिव्यक्ति का आकलन जो अन्य तकनीकों, के लिए लाभ प्रदान करता है मात्रात्मक RT-पीसीआर, जीनोम चौड़ा अभिव्यक्ति विश्लेषण या उत्तरी सोख्ता . मूल के उनके साइटों से सीधे होने वाले शाही सेना टेप visualizing करके, यह उदाहरण के लिए कर दिया गया हैजीन अभिव्यक्ति स्टोकेस्टिक 7 है, और कभी कभी 8 एलील विशिष्ट किया जा सकता है देखा. तकनीक में सुधार भी कोशिकाओं 9-11 भीतर ही mRNA अणुओं का पता लगाने और मात्रा का ठहराव की अनुमति दी है.
मछली के बुनियादी सिद्धांत अति विशिष्ट वाटसन और क्रिक आधार बाँधना के माध्यम से एक न्यूक्लिक एसिड जांच करने के लिए सेल के भीतर न्यूक्लिक एसिड के संकरण के होते हैं. जांच या तो सीधे या परोक्ष रूप से पता लगाया, microscopically देखे जा सकते हैं, जो एक संकेत के परिणामस्वरूप हो सकता है. आरंभिक प्रयास सुरक्षा मुद्दों, सीमित स्थानिक संकल्प और एक समय 12-14 में केवल एक ही लक्ष्य का पता लगाने की क्षमता के आधार पर कमियां थी जो radioactively लेबल जांच, शामिल थे. fluorochromes, haptens, और एंजाइमों सहित nonradioactive लेबल, के बाद के विकास, एक नियमित आणविक जीव विज्ञान तकनीक के रूप में मछली के व्यापक प्रसार के उपयोग की अनुमति दी है. मछली जांच या तो सीधे fluoroch के साथ लेबल किया जा सकता हैएसिड न्यूक्लिक को फ्लोरोसेंट अणु की रासायनिक लिंक के द्वारा Romes 15 और fluorescently लेबल nucleotides 16-19, या जांच परोक्ष रूप से (बायोटिन और digoxigenin सहित) haptens के एकीकरण और संयुग्मित hapten विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा haptens की प्रतिरक्षा पता लगाने के बाद देखे जा सकते हैं के एकीकरण के दृश्यों फ्लोरोसेंट संवाददाता 20-21 अणुओं. उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण मूल संकेत बढ़ाने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं जो fluorescently लेबल एंटीबॉडी के कई परतों का उपयोग करके संकेत प्रवर्धन की अनुमति देता है, और कम स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं जो शाही सेना प्रजातियों का पता लगाने में सक्षम बनाता है. प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष लेबलिंग तकनीक और विभिन्न haptens के संयोजन से, कई लक्ष्यों को एक साथ एक ही कक्ष में देखे जा सकते हैं.
मछली प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक अपने लक्ष्य को जांच के संकरण है. सिद्धांत रूप में, एक जांच विशेष रूप से व्यवहार में, अपने लक्ष्य के लिए ही बाध्य होगा हालांकि, इस विशिष्टताजांच मुताबिक़ क्षेत्रों के लिए बाध्य कर सकते हैं, हमेशा नहीं हासिल की है, और संकरण स्थितियां हमेशा एक निश्चित डीएनए क्षेत्र या शाही सेना प्रजातियों के लिए आदर्श नहीं होगा है. वे मछली प्रक्रिया की तंगी को बढ़ा सकते हैं, और पृष्ठभूमि शोर के एक उच्च स्तर पर नतीजा होगा मछली जो जांच की अविशिष्ट बंधन रोका जा सकता है जैसे बाद संकरण washes, इसलिए विशेष महत्व के हैं. शाही सेना अणु भी फंसे हैं के रूप में वे आसानी से एक मछली जांच संकरित किया जा सकता है. इसके विपरीत, डबल असहाय डीएनए अणु पहले एक जांच संकरण कर सकते हैं, जिसके बाद एक विकृतीकरण कदम, जरूरत है. यह आमतौर पर डीएनए का विकृतीकरण में जो परिणाम का नमूना हीटिंग, द्वारा हासिल की है. हालांकि, इन कठोर परिस्थितियों में, कमजोर, एकल असहाय आरएनए अणुओं लुप्त हो सकती हैं. इसलिए, संयुक्त डीएनए शाही सेना मछली की स्थिति का महत्वपूर्ण अनुकूलन की आवश्यकता है, और केवल शाही सेना या डीएनए की अलग पता लगाने की तुलना में अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है.
यहाँ हम presenप्रादेशिक सेना में विस्तृत हमें महिला माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं 22-24 फर्क में एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता (XCI) का अध्ययन करने के लिए अनुमति दी गई है, जो संयुक्त, एक साथ डीएनए शाही सेना मछली के प्रोटोकॉल. XCI एक महत्वपूर्ण epigenetic महिला भ्रूण विकास के 25 के लिए तंत्र, और heterochromatinization में परिणाम है और इसलिए महिला व्यक्तियों 26-27 में दो एक्स क्रोमोसोम में से एक का मुंह बंद. इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक RNF12 22-23 और REX1 24 प्रोटीन द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जो noncoding शाही सेना Xist 28-30, है. Xist अभिव्यक्ति भ्रूण के विकास के दौरान या इन विट्रो में ES सेल भेदभाव पर भविष्य निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र (ग्यारहवीं) पर upregulated हो जाता है , और एक्स गुणसूत्र के साथ फैला है और जिससे एक्स गुणसूत्र 31 के transcriptional शटडाउन में जो परिणाम chromatin remodeling एंजाइमों को आकर्षित कर सकते हैं. इस Xist शाही सेना के प्रसार एक्स chromo की एक परत के रूप में शाही सेना मछली से देखे जा सकते हैंकुछ भी एक Xist बादल के रूप में भेजा है. महिला ES कोशिकाओं जीनोमिक अस्थिरता की वजह से उनके एक्स गुणसूत्रों में से एक को खो सकते हैं, और हम दूसरों को यकीन ही karyotypically स्थिर कोशिकाओं को इस महत्वपूर्ण प्रक्रिया 22,32 के विश्लेषण में मूल्यांकन कर रहे हैं कि बनाने के लिए, XCI का अध्ययन करने के लिए संयुक्त डीएनए शाही सेना मछली कार्यरत है -34. हर आणविक जीव विज्ञान तकनीक के साथ के रूप में, कई अलग उत्कृष्ट प्रोटोकॉल 35-38 प्रकाशित किया गया है. यहाँ हम अनुमति देने के लिए माउस ES कोशिकाओं, कोशिकाओं का निर्धारण, निक अनुवाद, तय कोशिकाओं के पूर्व उपचार द्वारा मछली जांच की लेबलिंग में भेदभाव के शामिल होने से शुरू, हमारे विधि प्रस्तुत permeabilization और बाद में जांच तेज, जांच के संकरण लक्ष्य, और अंत में fluorescently लेबल एंटीबॉडी द्वारा जांच का पता लगाने. इस के साथ साथ प्रस्तुत प्रोटोकॉल Xist शाही सेना के वफादार का पता लगाने और दो दिन की अवधि के भीतर एक्स गुणसूत्र की अनुमति देता है, और इस तकनीक की मूल बातें संभावना ओ.टी. के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैउसकी व्यवस्था और अनुसंधान के क्षेत्रों में.
Protocol
Representative Results
Discussion
डीएनए मछली के लिए उपयुक्त स्थितियां कम स्थिर शाही सेना अणु के लिए भी कठोर हो सकता है के रूप में संयुक्त डीएनए शाही सेना मछली, तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है. कई तरीकों डीएनए और आरएनए दोनों का पता ल?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank all previous and present members of the department of Reproduction and Development of the Erasmus MC for helpful and stimulating discussions during the past years. We also want to thank the three anonymous reviewers for providing helpful feedback. Work in the Gribnau lab is supported by funding from the Dutch research council (NWO-VICI) and an ERC starting grant.
Materials
| female mouse embryonic stem cells | will be made available upon request | ||
| mouse embryonic fibroblasts | can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g Millipore | ||
| ES cell culture medium | DMEM, 15% foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM ß-mercaptoethanol, and 1000 U ml-1 LIF. Filter sterilize and store at 4ºC for maximal 2 weeks. | ||
| LIF | Chemicon | ESG1107 | |
| DMEM | Invitrogen | 11960085 | |
| Fetal Calf Serum | Invitrogen | 10099141 | |
| Penicillin–streptomycin (100×) | Invitrogen | 15140-122 | |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140-050 | |
| ß-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| ES cell differentiation medium | IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/l monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid | ||
| IMDM-Glutamax | Invitrogen | 31980-030 | |
| Ascorbic acid (50 mg/ml) | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| T25 cell culture dishes | Greiner Bio-one | 690160 | |
| 6-well cell culture dishes | Greiner Bio-one | 662160 | |
| cell culture grade PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS | Gibco | 25200-056 | |
| falcon tubes | Falcon | 352196 | |
| 24×24 mm coverslips | Menzle | 780882 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | prepare 4% PFA/PBS solutions, by dissolving PFA in PBS. Stir at 70 ᴼC until completely dissolved and cool down to room temperature. Aliquots can be stored at -20ᴼC |
| absolute 100% ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions |
| RNAse free water | Baxter | TKF7114 | |
| sterile filter tips | Rainin Bio Clean | GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F | |
| digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) | Roche | 11745816910 | |
| biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) | Roche | 11745824910 | |
| Sephadex G50 | Sigma-Aldrich | G5080 | |
| 2 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| sterilized cotton | |||
| eppendorf tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| yeast tRNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15401-029 | |
| Salmon Sperm DNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15632-011 | |
| mouse cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | 18440-016 | |
| eppendorf bench top microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
| Eppendorf Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| 2M NaAc, pH 5.6 | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| 50+ hybridization solution | 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7 | ||
| formamide | Acros organics | 3272350000 | |
| dextran sulfate | Fluka | 31403 | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | prepare a 0.2% solution in RNAse free water, and add 84 µl 37% HCL per 100 ml |
| HCL, 37% solution | Fluka | 84422 | |
| object glasses | Starfrost | 8037/1 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | dilute to 2x SSC in RNAse free water |
| 10 mM Phosphate buffer, pH 7 | add 57.7 ml of 1M Na2HPO4 and 42.3 ml 1M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave | ||
| denaturation buffer | 70% Formamide/2xSSC/10mM phosphate buffer pH 7 | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| 2M Tris pH 7.5 solution | |||
| Tris-Saline-Tween washing solution (TST) | 100 ml 10x Saline, 50 ml 2M Tris, 500 µl Tween-20, add RNAse free water till 1 liter | ||
| 10x Saline solution | dissolve 85 g NaCl in 1 liter RNAse free H2O, and autoclave | ||
| Tris-Saline-BSA (TSBSA) | 500 μl 10x Saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse free H2O | ||
| BSA, purified, 100x | New England Biolabs | B9001S | |
| sheep-anti-dig antibody | Roche diagnostics | use 1:500 diluted in TSBSA | |
| rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| mouse-anti-biotin antibody | Roche diagnostics | use 1:200 diluted in TSBSA | |
| donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| Tris-Saline washing solution (TS) | 10 ml 10x Saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O | ||
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| nail-varnish | |||
| fluorescent miscroscope |
Referências
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