Introdução de moléculas pequenas para o embrião de Drosophila em desenvolvimento oferece um grande potencial para a caracterização de actividade biológica de novos compostos, medicamentos e toxinas, bem como para sondar as vias de desenvolvimento fundamentais. Métodos descritos aqui delinear medidas que superem as barreiras naturais para essa abordagem, ampliando a utilidade do modelo embrião Drosophila.
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Artigo de método
Um método de permeabilização de
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Resumo
Resumo
O embrião Drosophila tem sido um modelo de laboratório poderosa para elucidar os mecanismos moleculares e genéticos que controlam o desenvolvimento. A facilidade de manipulação genética com este modelo suplantou abordagens farmacológicas que são comuns em outros modelos animais e ensaios baseados em células. Aqui, descrevemos os recentes avanços em um protocolo que permite a aplicação de moléculas pequenas para o desenvolvimento do embrião da mosca de fruta. O método detalha medidas para superar a impermeabilidade da casca do ovo, mantendo a viabilidade do embrião. Casca de ovo de permeabilização através de uma ampla gama de fases de desenvolvimento é conseguido através da aplicação de uma permeabilização anteriormente descrito embrião d-limoneno solvente (EPS 1) e pelo envelhecimento embriões, a temperatura reduzida (18 ° C) antes de tratamentos. Além disso, o uso de um corante vermelho-distante (CY5) como um indicador de permeabilização é descrito, o qual é compatível com aplicações a jusante, envolvendo gripe vermelho e verde padrãocorantes orescent em preparações ao vivo e fixos. Este protocolo é aplicável a estudos utilizando compostos bioativos para investigar os mecanismos de desenvolvimento, bem como para estudos destinados à avaliação da atividade teratogênica ou farmacológica de moléculas pequenas descaracterizados.
Introdução
O embrião Drosophila continua a ser um modelo privilegiado para investigação dos mecanismos fundamentais do desenvolvimento 2. Este modelo poderoso é suportada por uma grande variedade de técnicas de genética molecular que permitem a manipulação de essencialmente qualquer gene em qualquer ponto de tempo e dentro de qualquer órgão em desenvolvimento. O tamanho pequeno, rápido desenvolvimento, e uma extensa caracterização da morfogênese do embrião Drosophila torná-lo um modelo de escolha para as telas genéticos, muitos dos quais descobertos vias de desenvolvimento fundamentais 3,4. Numerosos fenótipos no embrião de Drosophila....
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Protocolo
1. Preparação das Culturas Fly, soluções e dispositivos de manuseio de embriões
- Prepara-se uma cultura de Drosophila gaiola. Coloque 500 moscas + acasalamento da tensão desejada em uma gaiola população equipado com uma placa de uva-agar 10 centímetros e uma mancha de levedura colar. Manter a cultura numa incubadora controlada de 25 ° C humidade. Nota: Gaiola culturas requerem um ou dois dias de condicionamento para obter padrões de embriões, que consistentes. Placas de uvas com levedura pasta são mudadas uma vez pela manhã e outra à noite durante o condicionamento.
- Prepare EPS. As soluções quentes de agentes tensioactivos....
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Resultados
Dispositivos de manipulação de embriões são apresentados na Figura 1 para auxiliar na visualização dos dispositivos de "home-made" para manipulação de protocolos acima. Os resultados observados na figura 2 ilustram o efeito robusto de criação de embriões a 18 ° C na sua capacidade de ser permeabilizada por EPS nas fases finais de desenvolvimento. Esta condição é aplicada no passo protocolo 2.1. A eficácia do corante ácido carboxílico CY5 para revelar os vários níveis de permea.......
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Discussão
O método acima descreve um meio para a obtenção de embriões viáveis de Drosophila, que são acessíveis para pequenos tratamentos da molécula através de uma gama ampla de desenvolvimento. Este método apresenta a nova e simples constatação de que o envelhecimento embriões a 18 ° C permite a permeabilização de embriões em estágio final com a mesma eficácia, como anteriormente visto apenas em embriões em estágio inicial. Além disso, a utilização do corante CY5 ácido carboxílico vermelha distante como um indicador .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo NIH / NIEHS R03ES021581 (concedido ao MDR) e pelo Centro de Saúde Ambiental da Universidade de Rochester (NIH / NIEHS P30 ES001247).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Gaiola para Mosca | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | pede pedido especial | http://www.stepan.com/ |
| Álcool etoxilado [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | pede pedido especial | http://www.stepan.com/ |
| d-limoneno (grau de pureza ultra alta) | Florida Chemical Co. | chamada para ordem especial | http://www.floridachemical.com/ |
| Hipoclorito de sódio | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS pó | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rodamina B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 ácido carboxílico | Lumiprobe | # 23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields e Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Membrana de oxigênio dissolvido (OD) | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| lamínula circular nº 1 de 25 mm | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Mistura para placa de ágar-uva | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
Referências
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu,, Reinitz, J. Drosophila blastoderm patterning. Curr Opin Gene....
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