Un<em> Ex vivo</em> Cultura sistema per studiare lo sviluppo della tiroide
Summary
This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.
Abstract
La tiroide è una ghiandola endocrina bilobated localizzata alla base del collo, producendo gli ormoni tiroidei T3, T4, e calcitonina. T3 e T4 sono prodotti da tireociti differenziati, organizzati in sfere chiusi chiamati follicoli, mentre calcitonina è sintetizzato dalle cellule C, intervallati tra i follicoli e una fitta rete di capillari sanguigni. Sebbene architettura tiroide adulto e funzioni sono state ampiamente descritte e studiato, la formazione delle unità "angio-follicolari", la distribuzione delle cellule C nel parenchima e le comunicazioni paracrini tra cellule epiteliali ed endoteliali è lungi dall'essere compresa.
Questo metodo descrive le fasi sequenziali di topo tiroide embrionale anlagen dissezione e la sua cultura sui filtri semiporoso o su scivoli di plastica microscopia. Entro un periodo di quattro giorni, questo sistema di coltura riassume fedelmente nello sviluppo della tiroide vivo. Infatti, (i) bilobation dell'organo verifica (per espianti E12.5), (ii) tireociti precursori organizzano in follicoli e polarizzano, (iii) tireociti e C-cellule si differenziano, e (iv) le cellule endoteliali presenti nel tessuto microdissezione proliferano, migrano nella lobi tiroidei, e strettamente associano con le cellule epiteliali, come fanno in vivo.
Tessuti tiroidei possono essere ottenute da wild type, knockout o embrioni transgenici fluorescenti. Inoltre, espianti coltura può essere manipolato per aggiunta di inibitori, bloccando anticorpi, fattori di crescita, o anche cellule o mezzo condizionato. Ex vivo sviluppo può essere analizzato in tempo reale, o in qualsiasi momento della coltura mediante immunoistochimica e RT-qPCR.
In conclusione, la cultura espianto tiroide combinato con a valle intera-mount o su sezioni di imaging e di espressione genica fornisce un potente sistema per manipolare e studiare morfogenetiche e differenziazione eventi della tiroide organogenesis.
Introduction
La tiroide è una raccolta di sfere epiteliali indipendenti, chiamati follicoli, circondato da una fitta rete di capillari endoteliali. Questa organizzazione permette la funzione della tiroide: i capillari endoteliali forniscono tireociti con iodio, necessari per T3 e T4 sintesi degli ormoni, e distribuire questi ultimi a tutto il corpo. Sparsi tra i follicoli e dei capillari, C-cellule producono l'ormone calcitonina hypocalcemic 1. Anche se l'architettura della tiroide adulti e le funzioni sono ben noti, i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella tiroide sviluppo embrionale (formazione del follicolo e differenziazione) sono lungi dall'essere compreso.
Durante l'embriogenesi, tireociti progenitore nasce come un ispessimento (anlage linea mediana) della parete ventrale del endoderma foregut al giorno embrionale (e) 8,5 nell'embrione topo, mentre cellule C progenitori origine a E11.5 come sporgenze a forma di gocciolina ( bo ultimobranchialmuore), della quarta tasche faringee 2-6. La gemma linea mediana stacca quindi dal endoderma, si espande bilateralmente a fondere a E13.5 con gli organi ultimobranchial su ogni lato della trachea. Infine, tireociti organizzano in follicoli e C-cellule si differenziano.
Le conoscenze attuali sulla formazione tiroide proviene principalmente da analisi istologica dei tessuti fissi, ma gli eventi morfogenetici coinvolti nella formazione tiroide sono altamente dinamico e coinvolgere comunicazioni e le interazioni tra diversi tipi di cellule e con la matrice extracellulare. Lavoro recente ha dimostrato che progenitori tireocita producono alti livelli di VEGF per reclutare cellule endoteliali alla tiroide sviluppo, e, a sua volta, reclutati cellule endoteliali promuovere la formazione del follicolo e cellule C differenziazione 7.
La maggior parte degli studi ex vivo sulla tiroide sono stati effettuati su cellule isolate adulte tiroide-derivato, coltivate in 2D coltura tissutale di plastica drocchie o in matrici 3D. L'utilizzo di questi tipi di culture, le cellule follicolari differenziate o rimanere polarizzata e organizzate come i follicoli o riacquisire un organismo 3D 8-10. Tuttavia, queste cellule epiteliali puri, espiantati dal loro ambiente fisiologico, e coltivate in 2D, ignorano interazioni con matrice extracellulare, citochine, fattori di crescita e con altri tipi cellulari, quali le cellule endoteliali o nervi che normalmente incontrano in vivo. Un bel studio recentemente descritto un protocollo di differenziazione delle cellule staminali in follicoli tiroidei con un passo di coltura in 3D matrigel 11. Tuttavia, queste culture 3D mancano contatto con altri tipi di cellule.
Sulla base delle esperienze precedenti su pancreas e ghiandole salivari cultura d'organo 12-14, un metodo per la dissezione del mouse embrionali anlagen tiroide e coltivando gli espianti sui filtri semiporoso o su scivoli di plastica microscopia stato sviluppato.
Quandolavorare con embrioni E12.5, la doppia origine del abbozzi tiroide (il anlage linea mediana e due corpi laterali ultimobranchial) ha imposto la microdissezione di un grande frammento di tessuto. Questo conteneva la trachea, ma non l'esofago, ed esteso dalle arterie arco faringeo fino a soffiatura aritenoidea. Quando coltivate su filtri, la anlage linea mediana si estende lateralmente su ciascun lato della trachea, dove si fondono con gli organi ultimobranchial per formare i due lobi tiroidei, ancora collegati da uno stretto istmo.
Nella cultura, cellule epiteliali proliferano, organizzano in follicoli e si differenziano in tireociti e cellule C, a seconda della loro origine. Le cellule endoteliali contenute nel tessuto microdissezione anche proliferano e invadono i lobi tiroidei associare finalmente stretto contatto con la struttura follicolare epiteliale, indipendentemente flusso sanguigno o fattori circolanti. Come sviluppo degli espianti riassume fedelmente in vivo svilupparezione, questo sistema di coltura è ottimale per studiare morfogenetica e gli eventi che si verificano durante lo sviluppo differenziazione tiroidea.
Tessuti tiroidei possono essere ottenute da wild type, knockout o embrioni transgenici fluorescenti, e il sistema cultura è suscettibile di perdita e di guadagno-di-funzione esperimenti. Infine, time-lapse imaging di espianti tiroidei fluorescente su piatti di plastica microscopia potrebbe essere sfruttata per studiare meglio la cinetica e la continuità dei movimenti morfogenetici che si verificano in vivo. Time-lapse imaging è già stata utilizzata per studiare branching morfogenesi del pancreas 15,16 o la gemma ureterale 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo documento descrive un metodo per la dissezione e la coltura espianti tiroidei (E12.5) o lobi (E14.5), al fine di studiare e comprendere meglio le complesse vicende che portano alla formazione della tiroide. Grazie alla duplice origine del anlagen tiroide (anlage linea mediana e due corpi laterali ultimobranchial), e le loro piccole dimensioni, un frammento di tessuto E12.5 rostrale localizzato alle arterie arco faringeo, e contenente la trachea, ma non l'esofago è microdissezione. Come illustrato, entro un p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by grants from the Université catholique de Louvain (Action de recherché concertées) and the Fund for Scientific Medical Research (F.R.S.-FNRS, Belgium). A.-S.D. is a doctoral fellow from Télévie, A.-C.H. held a fellowship from the Fonds pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture (Belgium), M.V. is supported by the de Duve Institute and C.E.P. is a senior research associate of the F.R.S.-FNRS (Belgium).
Materials
| µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile | proxylab | 80826 | |
| Collagen Type I, rat tail | Millipore | 08-115 | |
| Fibronectin from human plasma | Invitrogen | # 33010-018 | |
| M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
| Tungsten wire | Goodfellow | LS237450 | |
| culture plate insert (12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| E-cadherin | BD Biosciences | 610182 | 1/1000 |
| Ezrin | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
| PECAM | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
| Hoechst | Sigma | B2261 |
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