<em> Экс естественных</em> Культура Система по изучению развития щитовидной железы
Summary
This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.
Abstract
Щитовидная железа двудольное эндокринная железа локализуется у основания шеи, производя гормоны щитовидной железы Т3, Т4, и кальцитонин. T3 и T4 производятся дифференцированные тироцитов, организованных в закрытых сферах называемых фолликулов, а кальцитонин синтезируется С-клеток, которые чередуются между фолликулов и густой сетью кровеносных капилляров. Хотя взрослый архитектура и функции щитовидной железы широко описаны и изучены, формирование "ангио-фолликулярных" единиц, распределения С-клеток в паренхиме и паракринных связи между эпителиальных и эндотелиальных клеток далеко не понял.
Этот метод описывает последовательные стадии эмбриональных щитовидной ANLAGEN вскрытия и ее культуры на semiporous фильтров или на микроскопии пластиковых горок. В течение четырех дней, эта система культуры добросовестно повторяет в развитии щитовидной естественных условиях. В самом деле, (я) млрд.obation органа происходит (для эксплантов E12.5), (II) тироцитов предшественники организовать в фолликулах и поляризации, (III) тиреоциты и C-клетки дифференцируются, и (IV) эндотелиальные клетки, присутствующие в микродиссекции ткани пролиферируют, мигрируют в доли щитовидной железы, и тесно общаться с эпителиальных клеток, как они это делают в естественных условиях.
Тканей щитовидной железы может быть получен из дикого типа, нокаутом или флуоресцентных трансгенных эмбрионов. Кроме того, эксплантов культуры можно манипулировать добавлением ингибиторов, блокирующих антител, факторы роста или даже клетки или кондиционированной среды. Экс естественных развитие могут быть проанализированы в реальном времени или в любое время в культуре иммунного окрашивания и RT-КПЦР.
В заключение эксплантата щитовидной культуры в сочетании с последующей целом монтажа или на разделы изображений и экспрессия генов профилирования предоставляет мощную систему для манипулирования и изучения морфогенетических и дифференциации события щитовидной Organogenesis.
Introduction
Щитовидная железа представляет собой набор независимых эпителиальных сферах, называется фолликулы, в окружении густой сетью эндотелиальных капилляров. Такая организация позволяет функция щитовидной железы: эндотелиальные капилляры обеспечивают тироцитов с йодом, необходимые для T3 и T4 синтеза гормонов, и распространять эти последние на все тело. Переменная между фолликулов и капилляров, C-клетки производят hypocalcemic гормон кальцитонин 1. Хотя архитектура и функции взрослых щитовидной хорошо известны, клеточные и молекулярные механизмы, участвующие в щитовидной эмбрионального развития (образование фолликул и дифференцировки) далеки от понимания.
Во время эмбриогенеза, тироцитов прародитель возникает как утолщение (по средней линии закладки в) брюшной стенки энтодермы передней кишки в эмбриональный день (е) 8,5 у эмбрионов мышей, в то время как C-клетки предшественники происходят на E11.5 как капли выступов ( ultimobranchial боумирает) четвертого глоточных карманов 2-6. Срединная линия бутон затем отделяется от энтодермы, расширяет двусторонней основе сплавить в E13.5 с ultimobranchial органов на каждой стороне трахеи. Наконец, тиреоциты организовать в фолликулов и С-клетки дифференцируются.
Современные знания о формировании щитовидной железы, главным образом, происходит от гистологического анализа основных тканей, но морфогенетические события, участвующие в формировании щитовидной железы обладают высокой динамической и включают связи и взаимодействия между различными типами клеток и с внеклеточным матриксом. Недавние работы показали, что клетки-предшественники тиреоцитов производить высокие уровни VEGF по набору эндотелиальных клеток в развивающемся щитовидной железы, и, в свою очередь, набранных эндотелиальные клетки способствуют образованию фолликула и C-клетки дифференциация 7.
Большинство Экс Vivo исследования щитовидной железы были выполнены на изолированных щитовидной железы клеток, полученных взрослых, выращиваются либо на 2D культуре ткани пластиковая дгибнет или в 3D матриц. Используя эти типы культур, дифференцированные фолликулярные клетки либо остаются поляризованы и организованные, как фолликулов или повторно приобрести 3D организацию 8-10. Тем не менее, эти чистые эпителиальные клетки, эксплантированной от их физиологической среде и культивировали в 2D, игнорировать взаимодействия с внеклеточного матрикса, цитокинов, факторов роста и с другими типами клеток, таких как эндотелиальные клетки или нервов, что они обычно сталкиваются в естественных условиях. Очень хороший Исследование, недавно описал дифференциации протокол ЭС клеток в фолликулах щитовидной железы с использованием последний шаг культуры в 3D матригеле 11. Однако эти 3D культур не имеют контакта с другими типами клеток.
Основываясь на предыдущем экспертизы по поджелудочной железы и слюнных желез органов культуры 12-14, метод рассечения мышиных эмбриональных Anlagen щитовидной железы и культивирования эксплантов на semiporous фильтров или на микроскопии пластиковых горок была разработана.
Когдаработы с эмбрионами E12.5, двойной происхождение зачатков железы (по средней линии закладки в и две боковые ultimobranchial органы) ввел микродиссекции большого фрагмента ткани. Это содержится в трахею, но не пищевода, и простиралась от глотки арки артерий до черпаловидного набухания. При культивировании на фильтрах, по средней линии закладка проходит в поперечном направлении на каждой стороне трахеи, где они соединяются с ultimobranchial органов с образованием двух долей щитовидной железы, все еще соединенных узкой перемычкой.
В культуре, эпителиальные клетки размножаются, организовывать в фолликулах и дифференцироваться в тироцитов и С-клеток, в зависимости от их происхождения. Эндотелиальные клетки, содержащиеся в микродиссекции ткани также пролиферируют и проникают в долей щитовидной железы, наконец, связать в тесном контакте с эпителиальной фолликулярной структуры, независимо кровотока или циркулирующих факторов. Как развитие эксплантов добросовестно повторяет в естественных условиях развиватьния, эта система культуры является оптимальным для изучения морфогенетических и дифференциация события, происходящие во время развития щитовидной железы.
Ткани щитовидной железы могут быть получены из дикого типа, нокаутом или люминесцентных трансгенных эмбрионов, и система культуры поддается потери-и амплитудно-на-функции экспериментов. Наконец, покадровой визуализации флюоресцентно меченых эксплантатах щитовидной железы на микроскопии пластиковой посуды может быть использована, чтобы лучше исследовать кинетики и непрерывность морфогенетических движений, которые происходят в естественных условиях. Покадровой обработки изображений уже используется для изучения морфогенеза ветвления поджелудочной железы 15,16 или зачатка мочеточника 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта статья описывает способ рассечения и культивирования эксплантов щитовидной железы (E12.5) или долей (E14.5) с целью изучения и лучше понять сложные события, приведшие к образованию щитовидной железы. Из-за двойного происхождения зачатков щитовидной железы (по средней линии закладки в и …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by grants from the Université catholique de Louvain (Action de recherché concertées) and the Fund for Scientific Medical Research (F.R.S.-FNRS, Belgium). A.-S.D. is a doctoral fellow from Télévie, A.-C.H. held a fellowship from the Fonds pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture (Belgium), M.V. is supported by the de Duve Institute and C.E.P. is a senior research associate of the F.R.S.-FNRS (Belgium).
Materials
| µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile | proxylab | 80826 | |
| Collagen Type I, rat tail | Millipore | 08-115 | |
| Fibronectin from human plasma | Invitrogen | # 33010-018 | |
| M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
| Tungsten wire | Goodfellow | LS237450 | |
| culture plate insert (12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| E-cadherin | BD Biosciences | 610182 | 1/1000 |
| Ezrin | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
| PECAM | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
| Hoechst | Sigma | B2261 |
Referências
- Colin, I. M., Denef, J. -. F., Lengelé, B., Many, M. -. C., Gérard, A. -. C. Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units. Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).
- Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M. The developing mouse thyroid embryonic vessel contacts and parenchymal growth pattern during specification budding, migration, and lobulation. Dev. Dyn. 235 (2), 444-455 (2006).
- Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenesis of the thyroid gland. Mol. Cell. Endocrinol. 323 (1), 35-54 (2010).
- Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenetics of early thyroid development. J. Mol. Endocrinol. 46 (1), (2011).
- De Felice, M., Di Lauro, R. Thyroid development and its disorders genetics and molecular mechanisms. Endocr. Rev. 25 (5), 722-746 (2004).
- De Felice, M., Di Lauro, R. Intrinsic and extrinsic factors in thyroid gland development: an update. Endocrinology. 152 (8), 2948-2956 (2011).
- Hick, A. -. C., et al. Reciprocal epithelial paracrine interactions during thyroid development govern follicular organization and C-cells differentiation. Dev. Biol. 381 (1), 227-240 (2013).
- Toda, S., Koike, N., Sugihara, H. Cellular integration of thyrocytes and thyroid folliculogenesis: a perspective for thyroid tissue regeneration and engineering. Endocr. J. 48, 407-425 (2001).
- Toda, S., et al. Culture models for studying thyroid biology and disorders. ISRN Endocrinol. , (2011).
- Eggo, M. C., Quiney, V. M., Campbell, S. Local factors regulating growth and function of human thyroid cells in vitro and in vivo. 213, 47-58 (2003).
- Antonica, F., et al. Generation of functional thyroid from embryonic stem cells. Nature. 491, 66-71 (2012).
- van Eyll, J. M., Pierreux, C. E., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. Shh-dependent differentiation of intestinal tissue from embryonic pancreas by activin A. J. Cell Sci. 117, 2077-2086 (2004).
- Hick, A. -. C., et al. Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1. BMC Dev. Biol. 9. , (2009).
- Pierreux, C. E., et al. Epithelial:Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas. Dev. Biol. 347, 216-227 (2010).
- Puri, S., Hebrok, M. Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging. Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex-vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. , (2012).
- Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis in vitro. Dev. Biol. 271, 98-108 (2004).
