Un<em> Ex vivo</em> Sistema de Cultura para estudiar el desarrollo de la tiroides
Summary
This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.
Abstract
La tiroides es una glándula endocrina bilobated localizada en la base del cuello, la producción de las hormonas tiroideas T3, T4, y la calcitonina. T3 y T4 son producidos por tirocitos diferenciadas, organizadas en ámbitos cerrados llamados folículos, mientras que la calcitonina es sintetizada por las células C, intercalados entre los folículos y una densa red de capilares sanguíneos. Aunque la arquitectura y las funciones de la tiroides de adultos han sido ampliamente descritos y estudiados, la formación de las unidades "angio-foliculares", la distribución de células C en el parénquima y los comunicaciones paracrina entre las células epiteliales y endoteliales está lejos de ser comprendido.
Este método describe los pasos secuenciales de ratón tiroides embrionario disección esbozos y su cultura en los filtros semiporosas o en diapositivas de plástico de microscopía. Dentro de un período de cuatro días, este sistema de cultivo recapitula fielmente pt el desarrollo de la tiroides vivo. De hecho, (i) BILobation del órgano se produce (para explantes E12.5), (ii) tirocitos precursores se organizan en folículos y polarizan, (iii) tirocitos y células C diferencian, y (iv) las células endoteliales presentes en el tejido microdissected proliferan, migran a la lóbulos tiroideos y estrechamente se asocian con las células epiteliales, como lo hacen en vivo.
Los tejidos de la tiroides pueden ser obtenidos de tipo salvaje, nocaut o embriones transgénicos fluorescentes. Por otra parte, los explantes de cultivo se puede manipular mediante la adición de inhibidores, el bloqueo de anticuerpos, factores de crecimiento, o incluso células o medio acondicionado. Ex vivo de desarrollo se puede analizar en tiempo real, o en cualquier momento de la cultura mediante inmunotinción y RT-qPCR.
En conclusión, el cultivo de explantes de tiroides combinado con aguas abajo todo el montaje o en secciones de imagen y la expresión de genes de perfiles proporciona un sistema eficaz para la manipulación y el estudio de morfogénesis y diferenciación de eventos o de la tiroidesrganogenesis.
Introduction
La glándula tiroides es una colección de esferas epiteliales independientes, llamados folículos, rodeado de una densa red de capilares endoteliales. Esta organización permite que la función tiroidea: capilares endoteliales proporcionan tirocitos con yodo, necesarios para T3 y T4 síntesis de la hormona, y distribuir estas últimas a todo el cuerpo. Dispersos en entre los folículos y los capilares, las células C producen la hormona calcitonina hipocalcémico 1. Aunque la arquitectura y las funciones de la tiroides adultos son bien conocidos, los mecanismos celulares y moleculares implicados en el desarrollo embrionario de la tiroides (la formación del folículo y la diferenciación) están lejos de ser entendido.
Durante la embriogénesis, tirocitos progenitoras se origina como un engrosamiento (el primordio de la línea media) de la pared ventral del endodermo del intestino anterior en el día embrionario (E) 8,5 en el embrión de ratón, mientras que las células C progenitores se originan en E11.5 como salientes en forma de gotitas-( la bo ultimobranquialmuere) de la cuarta bolsas faríngeas 2-6. El brote de la línea media a continuación, se separa de la endodermo, se expande bilateralmente para fusionar en E13.5 con los cuerpos ultimobranquiales en cada lado de la tráquea. Finalmente, tirocitos se organizan en folículos y células C diferencian.
El conocimiento actual sobre la formación de tiroides proviene principalmente de análisis histológico de los tejidos fijos, pero los eventos morfogenéticos implicados en la formación de la tiroides son altamente dinámico e implican las comunicaciones e interacciones entre los diferentes tipos de células y con la matriz extracelular. Un trabajo reciente mostró que los progenitores tirocito producen altos niveles de VEGF para reclutar células endoteliales a la tiroides en desarrollo, y, a su vez, reclutan células endoteliales promueven la formación del folículo y la diferenciación de las células C 7.
La mayoría de los estudios ex vivo en la tiroides se han realizado en adultos células derivadas de la tiroides-aislados, crecido ya sea en 2D de cultivo de tejidos de plástico dparroquias o en 3D matrices. El uso de estos tipos de cultivos, las células foliculares bien diferenciados permanecer polarizados y organizados en folículos o adquirir de nuevo una organización 3D 8-10. Sin embargo, estas células epiteliales puras, explantados de su entorno fisiológico, y se cultivaron en 2D, ignoran las interacciones con la matriz extracelular, citoquinas, factores de crecimiento y con otros tipos de células tales como las células endoteliales o los nervios que normalmente se encuentran in vivo. Un estudio muy agradable describió recientemente un protocolo de diferenciación de células madre embrionarias en los folículos tiroideos utilizando una etapa de cultivo final en 3D Matrigel 11. Sin embargo, estos cultivos 3D carecen de contacto con otros tipos de células.
Basado en la experiencia anterior en el páncreas y las glándulas salivales de cultivo de órganos 12-14, un método para la disección de embriones de ratón Anlagen tiroides y el cultivo de los explantes sobre filtros semiporosas o en las diapositivas de plástico de microscopía fue desarrollado.
¿Cuándotrabajar con embriones E12.5, el doble origen de los esbozos de la tiroides (el esbozo de la línea media y los dos cuerpos laterales ultimobranquiales) impuso la microdisección de un gran fragmento de tejido. Este contenía la tráquea, pero no el esófago, y se extendió desde el arco faríngeo arterias hasta que la hinchazón aritenoides. Cuando se cultivan en filtros, el primordio de la línea media se extiende lateralmente a cada lado de la tráquea, donde se fusionan con los cuerpos ultimobranquiales para formar los dos lóbulos tiroideos, todavía conectadas por un estrecho istmo.
En cultivo, las células epiteliales proliferan, se organizan en folículos y se diferencian en tirocitos y células C, dependiendo de su origen. Las células endoteliales contenidas en el tejido microdissected también proliferan e invaden los lóbulos tiroideos para finalmente asociar estrechamente con la estructura folicular epitelial, independientemente del flujo de sangre o factores circulantes. Dado que el desarrollo de los explantes recapitula fielmente en vivo desarrollarción, este sistema de cultivo es óptima para estudiar morfogenética y eventos de diferenciación que ocurren durante el desarrollo de la tiroides.
Los tejidos de la tiroides pueden ser obtenidos de tipo salvaje, nocaut o embriones transgénicos fluorescentes, y el sistema de cultivo es susceptible a la pérdida-y los experimentos de ganancia de función. Por último, time-lapse de explantes de tiroides marcados con fluorescencia en placas de plástico de microscopía podría ser explotada para investigar mejor la cinética y la continuidad de los movimientos morfogenéticos que se producen in vivo. Time-lapse ya se ha utilizado para estudiar la morfogénesis de ramificación del páncreas 15,16 o la yema ureteral 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo se describe un método para la disección y el cultivo de explantes de la tiroides (E12.5) o lóbulos (E14.5) con el fin de estudiar y comprender mejor los complejos acontecimientos que conducen a la formación de la tiroides. Debido a la doble origen de la Anlagen tiroidea (la Anlage línea media y los dos cuerpos ultimobranquiales laterales), y su pequeño tamaño, un fragmento de tejido E12.5 rostral localizado en las arterias arco faríngeo, y que contiene la tráquea, pero no el esófago se microdis…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by grants from the Université catholique de Louvain (Action de recherché concertées) and the Fund for Scientific Medical Research (F.R.S.-FNRS, Belgium). A.-S.D. is a doctoral fellow from Télévie, A.-C.H. held a fellowship from the Fonds pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture (Belgium), M.V. is supported by the de Duve Institute and C.E.P. is a senior research associate of the F.R.S.-FNRS (Belgium).
Materials
| µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile | proxylab | 80826 | |
| Collagen Type I, rat tail | Millipore | 08-115 | |
| Fibronectin from human plasma | Invitrogen | # 33010-018 | |
| M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
| Tungsten wire | Goodfellow | LS237450 | |
| culture plate insert (12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| E-cadherin | BD Biosciences | 610182 | 1/1000 |
| Ezrin | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
| PECAM | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
| Hoechst | Sigma | B2261 |
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