Ett<em> Ex vivo</em> Kultur systemet studerar Thyroid Utveckling
Summary
This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.
Abstract
Sköldkörteln är en bilobated endokrin körtel lokaliserad vid basen av halsen, som producerar sköldkörtelhormon T3, T4, och kalcitonin. T3 och T4 produceras av differentierade thyrocytes, organiserade i slutna sfärer som kallas folliklar, medan kalcitonin syntetiseras av C-celler, insprängda i mellan folliklar och ett tätt nätverk av blod kapillärerna. Även vuxen sköldkörtel arkitektur och funktioner har utförligt beskrivits och studerats, är bildningen av "angio-follikulära" enheter, distribution av C-celler i parenkymet och parakrina kommunikationer mellan epitel-och endotelceller långt ifrån klarlagda.
Denna metod beskriver sekventiella steg av mus embryonala sköldkörtel anlagen dissekering och dess kultur på semiporous filter eller på mikroskopi plastglasen. Inom en period av fyra dagar, denna kultur systemet troget rekapitulerar in vivo sköldkörtelutveckling. I själva verket (i) miljarderobation av orgeln inträffar (E12.5 explantat), (ii) thyrocytes prekursorer organisera sig i hårsäckarna och polarisera, (iii) thyrocytes och C-celler differentierar, och (iv) endotel-celler närvarande i den microdissected vävnad föröka, migrera in i sköldkörtel lober och noga förknippar med epitelceller, som de gör i vivo.
Sköldkörtel vävnader kan erhållas från vildtypen, knockout eller fluorescerande transgena embryon. Dessutom explants kultur kan manipuleras genom tillsättning av inhibitorer, blockerande antikroppar, tillväxtfaktorer, eller till och med celler eller konditionerat medium. Ex vivo-utveckling kan analyseras i realtid, eller vid någon tidpunkt av kulturen genom immunfärgning och RT-qPCR.
Sammanfattningsvis, sköldkörtel Explantation kultur kombinerat med nedströms hel-fäste eller på sektioner imaging och genuttryck profilering ger ett kraftfullt system för att manipulera och studera morfogenetiska och differentierings händelser av sköldkörtel organogenesis.
Introduction
Sköldkörteln är en samling av oberoende epiteliala sfärer, som kallas folliklar, som omges av ett tätt nätverk av endothelial kapillärer. Denna organisation möjliggör sköldkörtelfunktionen: endothelial kapillärer ger thyrocytes med jod, som krävs för T3 och T4 hormonsyntes och distribuera dessa senare till hela kroppen. Utspridda i mellan folliklar och kapillärer, C-celler producerar hypokalcemisk hormonet kalcitonin 1. Även vuxna sköldkörtel arkitektur och funktioner är väl kända, de cellulära och molekylära mekanismer som är involverade i sköld embryonal utveckling (follikelstimulerande bildning och differentiering) är långt ifrån klarlagda.
Under embryogenes, thyrocytes stamfader sitt ursprung som en förtjockning (mittlinjen anlage) av den ventrala väggen i framtarmen endoderm på embryonala dag (e) 8.5 i musen embryot, medan C-celler gångare ursprung vid E11.5 som droppformade utsprång ( den ultimobranchial bodör) i den fjärde faryngeala påsarna 2-6. Mittlinje knopp lossnar därefter från endoderm, expanderar bilateralt att smälta vid E13.5 med ultimobranchial kroppar på vardera sidan av luftstrupen. Slutligen thyrocytes organisera sig i hårsäckarna och C-celler differentierar.
Aktuell kunskap om sköldkörtelbildningen kommer huvudsakligen från histologisk analys av fasta vävnader, men de morfogenetiska händelser som är involverade i sköldkörtel bildning är mycket dynamisk och involverar kommunikation och samspel mellan olika celltyper och med den extracellulära matrisen. Senare arbeten visade att thyrocyte progenitorceller producerar höga nivåer av VEGF för att rekrytera endotelceller till framkallnings sköldkörtel, och i sin tur rekryterade endotelceller främjar follikel bildning och C-celler differentiering 7.
De flesta ex vivo studier på sköldkörteln har utförts på isolerade vuxna thyroid-härledda celler odlas antingen på 2D vävnadsodling plast dishes eller i 3D-matriser. Med hjälp av dessa typer av kulturer, differentierade follikulära celler antingen förblir polariserat och organiserade som folliklar eller återförvärva en 3D organisation 8-10. Men dessa rena epitelceller, explanterade från deras fysiologiska miljön, och odlade i 2D, ignorera interaktioner med extracellulära matrix, cytokiner, tillväxtfaktorer och med andra celltyper, såsom endotelceller eller nerver celler som de normalt möter in vivo. En mycket trevlig studie beskrev nyligen en differentieringsprotokoll av ES-celler i sköldkörteln folliklar med en sista kultur steg i 3D matrigel 11. Emellertid är dessa 3D-kulturer saknar kontakt med andra celltyper.
Baserat på tidigare kunskap om bukspottkörtel och spottkörtlar organkultur 12-14, en metod för att dissekera mus embryonala sköldkörtel anlagen och odling explantaten på semiporous filter eller på mikroskopi plastglas utvecklades.
Närarbetar med E12.5 embryon, det dubbla ursprunget av sköld anlagen (mittlinjen anlage och de två sido ultimobranchial organ) införde microdissection av ett stort fragment av vävnad. Denna innehöll luftstrupen, men inte i matstrupen, och sträckte sig från svalg arch artärer upp till arytenoid svullnad. När de odlas på filter, sträcker sig mittlinjen anlage lateralt på vardera sidan av luftstrupen, där de smälter samman med de ultimobranchial organ för att bilda de två sköldkörtel lober, fortfarande förbundna genom ett smalt näs.
I kultur, epitelceller föröka sig, organisera sig i hårsäckarna och differentierar till thyrocytes och C-celler, beroende på deras ursprung. Endotelceller som finns i microdissected vävnaden föröka också och invadera sköld lober att äntligen associera nära med epitelial follikulära struktur, oberoende av blodflödet eller cirkulerande faktorer. Eftersom utvecklingen av explantaten rekapitulerar troget in vivo utvecklaning, är denna kultur systemet optimalt för att studera morfogenetisk och differentierings händelser som inträffar under sköldkörtel utveckling.
Sköldkörtel vävnader kan erhållas från vildtypen, knockout eller fluorescerande transgena embryon, och odlingssystemet är mottaglig för förlust-och gain-of-function experiment. Slutligen kan tidsförlopp avbildning av fluorescerande sköldkörtel explants på mikroskopi plastskålar utnyttjas för att bättre undersöka kinetiken och kontinuitet morfogenetiska rörelser som sker in vivo. Time-lapse avbildning har redan använts för att studera förgrening morfogenes i bukspottkörteln 15,16 eller ureteric knoppen 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta dokument beskriver en metod för att dissekera och odling av sköldkörtel explants (E12.5) eller lober (E14.5) i syfte att studera och bättre förstå de komplexa händelser som leder till sköldkörteln bildas. På grund av den dubbla ursprung i sköld anlagen (mittlinjen anlage och de två laterala ultimobranchial kroppar) och sin ringa storlek, ett fragment av E12.5 vävnad lokaliserad rostralt till svalg arch artärer och innehållande i luftstrupen, men inte i matstrupen är microdissected. Som visas, inom …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by grants from the Université catholique de Louvain (Action de recherché concertées) and the Fund for Scientific Medical Research (F.R.S.-FNRS, Belgium). A.-S.D. is a doctoral fellow from Télévie, A.-C.H. held a fellowship from the Fonds pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture (Belgium), M.V. is supported by the de Duve Institute and C.E.P. is a senior research associate of the F.R.S.-FNRS (Belgium).
Materials
| µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile | proxylab | 80826 | |
| Collagen Type I, rat tail | Millipore | 08-115 | |
| Fibronectin from human plasma | Invitrogen | # 33010-018 | |
| M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
| Tungsten wire | Goodfellow | LS237450 | |
| culture plate insert (12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| E-cadherin | BD Biosciences | 610182 | 1/1000 |
| Ezrin | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
| PECAM | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
| Hoechst | Sigma | B2261 |
Referências
- Colin, I. M., Denef, J. -. F., Lengelé, B., Many, M. -. C., Gérard, A. -. C. Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units. Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).
- Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M. The developing mouse thyroid embryonic vessel contacts and parenchymal growth pattern during specification budding, migration, and lobulation. Dev. Dyn. 235 (2), 444-455 (2006).
- Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenesis of the thyroid gland. Mol. Cell. Endocrinol. 323 (1), 35-54 (2010).
- Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenetics of early thyroid development. J. Mol. Endocrinol. 46 (1), (2011).
- De Felice, M., Di Lauro, R. Thyroid development and its disorders genetics and molecular mechanisms. Endocr. Rev. 25 (5), 722-746 (2004).
- De Felice, M., Di Lauro, R. Intrinsic and extrinsic factors in thyroid gland development: an update. Endocrinology. 152 (8), 2948-2956 (2011).
- Hick, A. -. C., et al. Reciprocal epithelial paracrine interactions during thyroid development govern follicular organization and C-cells differentiation. Dev. Biol. 381 (1), 227-240 (2013).
- Toda, S., Koike, N., Sugihara, H. Cellular integration of thyrocytes and thyroid folliculogenesis: a perspective for thyroid tissue regeneration and engineering. Endocr. J. 48, 407-425 (2001).
- Toda, S., et al. Culture models for studying thyroid biology and disorders. ISRN Endocrinol. , (2011).
- Eggo, M. C., Quiney, V. M., Campbell, S. Local factors regulating growth and function of human thyroid cells in vitro and in vivo. 213, 47-58 (2003).
- Antonica, F., et al. Generation of functional thyroid from embryonic stem cells. Nature. 491, 66-71 (2012).
- van Eyll, J. M., Pierreux, C. E., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. Shh-dependent differentiation of intestinal tissue from embryonic pancreas by activin A. J. Cell Sci. 117, 2077-2086 (2004).
- Hick, A. -. C., et al. Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1. BMC Dev. Biol. 9. , (2009).
- Pierreux, C. E., et al. Epithelial:Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas. Dev. Biol. 347, 216-227 (2010).
- Puri, S., Hebrok, M. Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging. Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex-vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. , (2012).
- Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis in vitro. Dev. Biol. 271, 98-108 (2004).
