Analyse détaillée de la dynamique de transcription à partir d'échantillons de cerveau après l'expérience comportementale
Summary
This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.
Abstract
L'encodage d'expériences dans le cerveau et la consolidation de la mémoire à long terme dépend de la transcription des gènes. Identifier la fonction de gènes spécifiques dans l'expérience de codage est l'un des principaux objectifs de la neuroscience moléculaire. En outre, l'association fonctionnelle des gènes définis avec des comportements spécifiques a des implications pour la compréhension de la base de troubles neuropsychiatriques. L'induction de la transcription des programmes de solides a été observée dans le cerveau des souris après diverses manipulations du comportement. Bien que certains éléments génétiques sont utilisées de manière récurrente suivant différentes manipulations et de comportement dans différents noyaux du cerveau, les programmes de transcription sont globalement unique pour les stimuli induisant la structure et dans laquelle elles sont étudiées 1,2.
Dans cette publication, un protocole est décrit solide et complet pour le profilage de la transcription à partir de noyaux de cerveau de souris en réponse à la manipulation du comportement. Laprotocole est mise en évidence dans le cadre de l'analyse de la dynamique de l'expression des gènes dans le noyau accumbens suivant l'expérience de la cocaïne aiguë. Suite à une défini dans l'expérience in vivo, le tissu neural cible est disséqué; suivi par la purification de l'ARN, la transcription inverse et l'utilisation de matrices microfluidiques pour analyse qPCR complet de plusieurs gènes cibles. Ce protocole est axé sur une analyse complète (adressage 50-500 gènes) de limiter les quantités de matière première, tels que des échantillons de cerveau petites ou même des cellules individuelles.
Le protocole est le plus avantageux pour l'analyse en parallèle de plusieurs échantillons (par exemple, les cellules individuelles, l'analyse dynamique suivante pharmaceutique, virale ou perturbations comportementales). Toutefois, le protocole pourrait également servir pour l'assurance de la caractérisation et de la qualité des échantillons avant les études du génome entier par des puces ou RNAseq, ainsi que la validation des données obtenues à partir des études du génome entier.
Introduction
Organisation dynamique du cerveau permet la flexibilité cognitive et comportementale. Les expériences sont codées par des modifications de la structure et de la force des connexions entre les neurones dans le cerveau 3. Cette «plasticité expérience dépendant" est le résultat de l'induction des modes spécifiques de l'expression du gène qui fournit les protéines nécessaires à la modification de la structure et de la force synaptique 4. L'identification des réseaux de régulation génétique médiation de la formation de la mémoire à long terme est un élément central de la neuroscience moléculaire, avec l'espoir que l'identification des éléments dominants de programmes de transcription donnera un aperçu des principes fondamentaux qui régissent la formation de la mémoire, ainsi que des objectifs pour traitement des maladies neurodégénératives et des troubles neuropsychiatriques. Programmes de transcription se déroulent dans les vagues temporellement définis, chacun des gènes qui codent des caractères différents, qui sont importants pour différents étapes dans la mise en œuvre des résultats de l'événement de signalisation 1,2. Il est donc important d'aborder la dynamique de la transcription sur un délai temporel détaillée, afin d'identifier la liste complète des gènes induits, et pour mieux comprendre leur fonction de potentiel selon la dynamique de leur induction.
La toxicomanie est une forme robuste de plasticité dépendant de l'expérience causée par les effets à long terme de l'abus des drogues sur les circuits neuronaux dans le cerveau 5,6. , L'exposition aiguë initiale aux médicaments peut conduire à l'apparition de la toxicomanie et de la transition vers l'utilisation chronique. Les informations contextuelles est un élément crucial dans le développement de la toxicomanie. Signaux environnementaux associés au médicament sont affectés une grande importance dans l'esprit des toxicomanes. Les informations contextuelles rappelant un toxicomane de l'expérience passée de drogues peut induire une rechute de l'état de manque, même après de longues périodes d'abstinence de l'exposition au médicament 7,8.D'où le grand défi clinique dans la dépendance – la propension des toxicomanes à la rechute, même longtemps après que les symptômes de sevrage ont disparu 9.
La sensibilisation comportementale à la cocaïne est un modèle simple de l'expérience de la cocaïne utiles dans l'étude des mécanismes de la toxicomanie. Dans ce modèle largement étudié pour la sensibilisation de longue durée induite par l'exposition chronique aux drogues d'abus, les rongeurs sont d'abord habitués à des injections de solution saline (de intrapéritonéale; IP) dans un nouvel environnement (une chambre ouverte sur le terrain où leur activité locomotrice est surveillée) ; ensuite, ils reçoivent des injections quotidiennes de cocaïne dans les chambres en plein champ, tandis que leur activité est contrôlée 10 (figure 1). Ce paradigme comportemental se traduit généralement par une sensibilisation robuste de comportement locomoteur (8-12 fois supérieure à l'activité de base) 11, qui est maintenue pendant une période de plusieurs mois après l'arrêt des injections de cocaïne, ce qui montre la formation d'un perversasive trace mnésique de l'expérience de la drogue.
Les circuits neuronaux de la récompense, naturellement impliqué dans le renforcement des comportements essentiels pour le succès d'une espèce (par exemple, l'alimentation, le sexe), est exploitée par l'abus des drogues à renforcer les comportements de drogue associé 12,13. Les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels l'expérience de l'abus des drogues est renforcée semblent être similaires aux mécanismes sous-jacents de la formation des souvenirs déclaratifs ou sémantiques dans d'autres structures cérébrales 14. Par conséquent, la robustesse du modèle de sensibilisation comportementale en fait un système modèle attractif pour étudier les mécanismes d'expérience dépendant de plasticité.
Le noyau accumbens (NAC) est un intégrateur central du circuit de récompense du cerveau, et a été largement associée au développement de la dépendance à 5,6. La formation de la dépendance dépend de la transcription de nouvelles protéines dans le noyau accumbens et robusteproduction de programmes de transcription clairement structurés est observée dans le NAc suivante expérience de la cocaïne 15-19. L'réponse transcriptionnelle aiguë à l'exposition de la cocaïne est susceptible de fonctionner à plusieurs niveaux afin de s'adapter à la relance de forte induction et d'orienter la production de nouvelles protéines qui sont responsables des changements structurels et électrophysiologiques induites par l'exposition au médicament 6,19-22.
Afin de promouvoir l'étude des mécanismes moléculaires de la plasticité dépendant de l'expérience dans le cerveau, un protocole est décrit pour l'analyse globale de la dynamique de transcription dans des échantillons de tissu cérébral qui suit manipulation comportementale. Le protocole est illustré dans le cadre de l'expérience du comportement étudié dans le laboratoire Citri – la sensibilisation comportementale à la cocaïne, en utilisant les tableaux dynamiques microfluidiques pour analyse transcriptionnelle. Le protocole décrit n'est évidemment pas limitée à l'étude de til noyau accumbens, dans le cadre de la sensibilisation comportementale, mais pourrait être appliquée à un grand nombre de paradigmes comportementaux et les régions du cerveau. En fait, ce protocole peut être appliqué aux tissus de l'organisme à l'extérieur du cerveau, et une variété d'expériences ou des manipulations de l'organisme étudié.
Le protocole est grossièrement divisé en quatre étapes. Dans la première étape, l'animal est soumis au paradigme comportemental; dans la seconde étape, le tissu est microdissection; dans la troisième étape – l'ARNm est purifié, à une transcription inverse et de sonde, et dans l'étape finale, les données sont analysées.
Dans le cadre de l'étude de la dynamique de la transcription, la synchronisation précise et la définition de l'expérience sont probablement paramètres expérimentaux les plus importants à contrôler. Pour cette raison, le modèle de comportement de choix est celui de la sensibilisation comportementale à la cocaïne, un système qui permet un niveau élevé de contrôle de l'expérimentateur sur les paramètres de l'expéCE. Paradigmes comportementaux supplémentaires qui permettent une synchronisation précise et traitent les différents modèles de plasticité dépendant de l'expérience ou de la formation de la mémoire sont disponibles. Ces modèles comprennent conditionnement de la peur 23, l'enrichissement environnemental aigu 24,25, roman objet exploration 26 et expérience visuelle suivante élevage sombre 27. Pourtant, la sensibilisation comportementale à la cocaïne est une manipulation du comportement solide et cohérent, la création d'une trace de mémoire hautement invasive qui dure depuis des mois suivants expérience de cocaïne 28.
Le cerveau est sectionné, suivie par microdissection manuel de noyau accumbens. Il a été notre expérience que la microdissection manuel de tranches de cerveau préparés rapidement fournit la méthode la plus fiable et rapide de l'extraction du tissu concerné au paradigme comportemental, et avec l'expérience, les limites du tissu devenu évident et facilement reconnaissables. Sinon, fines tranches pourraient être prépared, suivie par laser capture microdissection. Bien que ce procédé permet de fortement délimitation de la région d'intérêt définie, il est lent (risquant ainsi la perte d'ARNm labile), fastidieux et nécessite un équipement coûteux dédié (un microscope équipé d'une installation laser de capture). Le protocole défini dans ce document peut également être adapté à l'analyse de la transcription de cellules isolées, par aspiration manuelle du cytoplasme des cellules identifiées visuellement à l'aide de pipettes de patch 29. Il est important de noter que le protocole décrit fournit une moyenne de la population, alors qu'il est très probable que dans la plupart des cas, seule une sous-population de cellules dans le tissu sont effectivement impliqués dans la réponse à l'expérience. Il est intéressant de profil transcription d'une manière sélective au sein de populations de cellules spécifiques répondant à l'expérience, mais la discussion de ces approches est au-delà de la portée actuelle.
Pour la purification de l'ARNm, la transcription inverse et qPCR interrogation, le tissuest perturbé par passage à travers de fines aiguilles, suivie par l'utilisation de kits disponibles dans le commerce (pour plus d'informations, voir le tableau 8). Le choix est informé par l'expérience de ces méthodes, qui assurent l'extraction fiable de l'ARN de haute qualité et des résultats solides à partir d'applications en aval.
Alors que le protocole est décrit par qPCR à haut débit en utilisant des tableaux dynamiques, les échantillons peuvent être sondés pour l'expression de gènes en utilisant la PCR point final, à faible débit qPCR, puces géniques d'expression ou le séquençage de profondeur. La préférence pour la PCR quantitative à haut débit en utilisant des tableaux dynamiques est due au fait que l'ARNm obtenu à partir de noyaux cérébraux suivant paradigmes comportementaux est souvent de quantités limitantes. Les tableaux dynamiques fournissent une plate-forme qui permet l'analyse globale efficace de la transcription à partir d'un grand nombre d'échantillons parallèles en une seule expérience. Après l'acquisition initiale du système microfluidique (généralement une unité centrale institutionnelrchase), les expériences sont relativement peu coûteux à exécuter. Suite à cette analyse, outre l'interrogation des échantillons peut être effectuée en utilisant des plates-formes plus coûteuses pour rechercher de nouveaux relevés de notes (biopuces ou RNAseq) avec les tableaux dynamiques fournir une référence complète pour l'assurance de la qualité. Enfin, l'analyse des données, les approches classiques sont utilisés. Pointeurs spécifiques concernant les problèmes qui pourraient survenir seront discutés dans le texte du protocole.
Ce protocole est le plus approprié pour les enquêteurs s'intéressent à une enquête approfondie de leur système d'intérêt, l'étude de plusieurs conditions et répétitions. Le protocole est également le plus approprié pour les enquêteurs qui ont déjà acquises dans (à travers des expériences de puces à ADN ou RNAseq) sur un sous-ensemble de 50-500 gènes d'intérêt, qu'ils sont intéressés à interroger à plusieurs reprises.
Protocol
Representative Results
Discussion
Caractérisation succès de l'expression des gènes du tissu cérébral qui suit paradigmes comportementaux dépend: 1) Une manipulation soigneuse des souris pendant le paradigme comportemental; 2) dissection rapide et précise des tissus d'intérêt; 3) les mesures d'ARN de sécurité pour assurer l'intégrité de l'ARN; et 4) la planification minutieuse des amorces et dispositif expérimental ainsi que la précision et l'attention au détail dans la préparation de l'analyse qPCR.
<p cl…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been funded by the Israel Science Foundation Grant (ISF # 393/12), Israel Centers of Research Excellence Grant (I-CORE 1796/12), German-Israel Foundation Grant (GIF # 2299-2291.1/2011) and the Marie Curie Career Integration Grant (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201). Initial steps in the project were funded by an AXA postdoctoral fellowship to AC. We acknowledge the generous startup funds provided by the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences.
Critical reading by members of the Citri lab is greatly appreciated.
Materials
| Virusol | Oriek Medical | J29D | |
| Isoflurane, USP 100% | MINRAD INC | NDC 60307-110-25 | |
| RNeasy plus Universal Mini Kit | QIAGENE | 73404 | |
| QIAshredder | QIAGENE | 79654 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Invitrogene | AB-4368814 | |
| TE Buffer | Invitrogene | 1355656 | |
| Behaviour Chamber (MDF; 50X45cm) | Self assembled | ||
| Inner Perspex box (30X30cm) | Self assembled | ||
| camera and video recorder | Campden Inst | CMD-80051 | |
| Media Recorder software | Noldus | NDS-NMR3-00M | |
| Iris Scissors | FST | FST-14062-09 | |
| Sagital Brain slicer with a 0.5mm section | Brain Tree Scientific | BS-AL-505S | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | The Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1852048 | |
| Inverted microspun spatula | Bochem Instrument GmbH | 3213 | |
| Biomark HD Reader | Fluidigm | BMHD-BMKHD | |
| Dynamic array Chip for 96.96gene expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 |
Referências
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