行動経験に続いて脳試料からの転写動態の網羅的解析

Summary

This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.

Abstract

脳と長期記憶の統合の経験の符号化は、遺伝子転写に依存する。経験をコード内の特定の遺伝子の機能を同定することは、分子神経科学の主な目的の一つである。さらに、特定の動作で定義された遺伝子の機能的関連は、精神神経疾患の基礎を理解するための意味を持っている。堅牢な転写プログラムの誘導は、さまざまな行動の操作後のマウスの脳で観察されている。いくつかの遺伝的要素が異なる行動の操作に従い、異なる脳核内に再帰的に利用されているが、転写プログラムは、全体的な誘導の刺激、彼らは^1,2を研究されている構造に固有のものです。

この公報では、プロトコルは、行動操作に応じてマウスの脳の核から、堅牢で包括的な転写プロファイリングに記載されている。ザ·プロトコルは、急性コカイン経験以下の側坐核における遺伝子発現動態の分析の文脈において明らかにされる。 生体内での経験で定義されているに続いて、標的神経組織が ​​解剖されている。 RNA精製に続いて​​、複数の標的遺伝子の総合的なqPCR分析のためのマイクロ流体アレイの転写と使用率を反転させます。このプロトコルは、このような小さな脳試料または単一の細胞のような出発物質の制限量を総合的に分析（50〜500の遺伝子をアドレッシング）を目指している。

プロトコルは、複数のサンプルの平行分析（ 例えば単一細胞、製薬以下動的解析、ウイルスまたは行動摂動）が最も有利で ​​ある。ただし、プロトコルは、マイクロアレイまたはRNAseqによって全ゲノムの研究の前に、サンプルの特性評価および品質保証のために役立つだけでなく、全ゲノム研究から得られたデータの検証ができた。

Introduction

脳の動的な組織は、認知および行動の柔軟性を可能にします。経験は、脳³のニューロン間の接続の構造や強度の修飾を通してエンコードされます。この「経験依存可塑性」とは、シナプスの構造と強度⁴の修正のために必要なタンパク質を提供する遺伝子発現の特定のパターンの誘導の結果である。長期的な記憶の形成を仲介する遺伝子調節ネットワークの同定は、転写プログラムの主要な要素の識別のための記憶形成だけでなく、目標を規制する基本原則への洞察を提供することを期待して、分子神経科学の中心的信条です神経変性および神経精神障害の治療。転写プログラムは、Dのために重要である別の文字の遺伝子をコードし、それぞれが、時間的に定義された波のように展開シグナリング事象^1,2の結果の実装にifferent段階。それは、誘発された遺伝子の完全な補完を識別し、それらの誘導の動態に応じてそれらの潜在的な機能への洞察を得るように、詳細な時間的な時間スケールでの転写ダイナミクスに対処することが重要である。

薬物中毒は脳の^5,6における神経回路上の乱用薬物の長期的な効果によって引き起こされる経験依存可塑性の堅牢な形式です。薬への初期、急性暴露は、中毒の開発および慢性使用への移行につながる可能性がある。コンテキスト情報は、依存症の発達における重要な要素である。医薬品関連の環境手がかりは、薬物乱用者の心の中の重要な重要性が割り当てられます。過去の薬物経験の薬物乱用者に思い出させるコンテキスト情報があっても薬物暴露^7,8から禁欲長期間以下の薬物渇望に再発を誘導することができる。したがって中毒に大きな臨床上の挑戦-禁断症状が⁹沈静化した後、中毒者の傾向があっても、長い再発する。

コカインへの行動感作は、薬物中毒のメカニズムの研究に有用コカインの経験を単純なモデルである。乱用薬物への慢性曝露によって誘発される長期的な感作のためのこの広く研究されたモデルでは、げっ歯類は、まず生理食塩水の注射（腹腔内; IP）に慣らしている小説の環境で（彼らの自発運動を監視されているオープンフィールドチャンバー） ;彼らの活動は^10（ 図1）をモニタしながら、その後、彼らはオープンフィールドチャンバー内のコカインの毎日の注射を受ける。この行動パラダイムは、典型的には、PERVの形成を示す、コカイン注射の停止を以下ヶ月間維持され^、11（ベースライン活性を上記の8〜12倍）運動行動の堅牢感をもたらす薬物経験のasive記憶痕跡。

自然種（ 例えば摂食、性別）の成功に不可欠な行動を強化にかかわる報酬の神経回路は、薬物関連行動^12,13を補強するために乱用薬物によって利用されている。乱用薬物の経験が増強されることにより、分子·細胞メカニズムは、他の脳構造¹⁴内の宣言型または意味記憶の形成のメカニズムと類似していると思われる。そのため、行動感モデルの頑健性は経験依存可塑性のメカニズムを研究するための魅力的なモデル系になります。

側坐核（NAC）は、脳の報酬回路の中心積分器であり、広く中毒^5,6の発症と関連している。中毒の形成は、側坐核における新規タンパク質の転写に依存し、ロバスト明確に構造化転写プログラムの生産は、コカインの経験^15-19以下の側坐核において観察される。コカイン曝露に対する急性転写応答が強い誘導刺激に適応する、新たなタンパク質の産生を指示するために、複数のレベルで機能する可能性が高いこと薬剤^6,19-22への曝露によって誘発される構造的および電気生理学的変化の原因である。

脳における経験依存的可塑性の分子機構の研究を促進するために、プロトコルは、行動操作後の脳組織試料中の転写動態の包括的な分析のために記載されている。転写分析のためのマイクロ流体動的配列を用いて、コカインに対する行動感作 – プロトコルはミカンハダニ室で研究された行動の経験と関連して示されている。記載されているプロトコルは明らかにトンを研究に限定されるものではない彼は、行動感作のコンテキストで側坐核の核が、行動パラダイムと脳の多数の領域に適用することができる。実際に、このプロトコルは、脳の外側の身体組織に適用することができ、経験または生物の操作のさまざまな検討を行った。

プロトコルは、大きく4つの段階に分けられる。最初のステップでは、動物は、行動パラダイムに供される。第二工程において組織顕微解剖され;第三工程で – mRNAは、逆転写及びプローブし、精製し、そして最終工程でデータが分析される。

転写ダイナミクスを研究の文脈では、経験の正確なタイミングと定義は、おそらくコントロールする最も重要な実験パラメータである。このため、選択した私達の行動モデルは、の体験のパラメータに対する実験者の高レベルの制御を可能にするシステム、コカインに対する行動感作のものであるCE。経験依存可塑性や記憶形成の異なるモデルを正確なタイミングを有効にして対処する追加の行動パラダイムを利用できます。これらのモデルは、恐怖条件付け^23、急性環境エンリッチメント^24,25、新規オブジェクトの探査²⁶と暗い飼育²⁷以下の視覚体験が含まれています。それでも、コカインに対する行動感作は、コカインの経験^28を次の数ヶ月続く非常に普及したメモリ·トレースの作成 ​​、一貫して強固な行動操作である。

脳は、側坐核の手動マイクロダイセクションが続き、区分されている。これは、急速に準備脳スライスからの手動マイクロダイセクションは、行動パラダイムに関連する組織を抽出する最も信頼性が高く迅速な方法を提供することが私たちの経験をされており、経験を、組織の境界が明らかになり、容易に認識した。代わりに、細かいスライスがprepar可能性レーザーキャプチャーマイクロダイセクションが続く編、。この方法は、関心領域の高度に規定された描写を可能にしますが、それは、（このように不安定なmRNAの損失を危険にさらして）遅く面倒でコストのかかる専用の機器（レーザーキャプチャーセットアップを装着し、顕微鏡）が必要です。ここに定義されたプロトコルはまた、パッチピペット^29を使用して視覚的に同定された細胞の細胞質の手動吸引によって、単一細胞の転写分析に適合させることができる。それはほとんどの場合、組織内の細胞の亜集団のみが実際に経験に応答に関与している可能性が高いものの、記述されたプロトコルは、母集団平均を提供することに留意することが重要である。それは経験に応答する特定の細胞集団の中から選択的に転写をプロファイリングすることが重要であるが、これらのアプローチの議論は、現在の範囲を超えています。

mRNA精製のために、逆転写および定量PCR照会、組織を市販のキットを利用して、その後細い針、を通過させることにより破壊されている（詳細については、 表8を参照）。選択は、高品質のRNAと下流のアプリケーションから堅固な成果を保証抽出を確実にこれらの方法論、経験によって通知される。

プロトコルは、動的配列を用いたハイスループット定量PCRのために記載されているが、サンプルがエンドポイントPCR、低スループット定量PCR、遺伝子発現マイクロアレイまたは深いシーケンシングを使用して遺伝子発現についてプローブすることができる。ハイスループットqPCRには、動的配列を利用するための好みは、mRNAが行動パラダイムに従うことは、多くの場合、制限量のある脳核から得ているという事実によるものである。動的配列は、単一の実験で並列多数のサンプルからの転写物の効率的な総合的な分析を可能にするプラットフォームを提供します。マイクロ流体システム（一般機関投資PUの初期捕捉した後、rchase）、実験は実行することが比較的安価である。この分析に続いて、試料の更なる問い合わせは、品質保証のための総合的なリファレンスを提供する動的な配列で（マイクロアレイまたはRNAseqによって）は、新規転写産物を検索するために、より高価なプラットフォームを使用して実行することができた。最後に、データ分析のために、標準的なアプローチが利用される。発生する可能性がある問題について具体的なポインタはプロトコルの文章で説明します。

このプロトコルは、複数の条件との複製を研究、関心のある彼らのシステムの徹底的な調査に興味を持って研究者のために最も適しています。プロトコルは、すでに彼らは繰り返しクエリするに興味を持っている関心のある50〜500の遺伝子のサブセット（マイクロアレイまたはRNAseq実験により）で磨いてきた研究者に最適です。

Protocol

注：プロトコルは、エルサレムのヘブライ大学の動物ケアのガイドラインに従っています。 ACSF溶液の調製適切な水の添加またはNaClで〜300mOsmで/ Lに浸透圧をもたらし、 表1に記載したように、OのddH 2で1リットルを加えます。ACSF溶液を調製（> 18MΩ純度）。 2。機器とルームセットアップコカイン…

Representative Results

このプロトコルを適用して得られた結果の質は、決定的なパラメータの数に依存する。適切な実験計画は経験がテストされるように、実験用マウスに最小限の妨害になります（この例では、コカインにさらされること）が彼らの最近の歴史の中で最も支配的な経験になりますので、堅牢で特異的転写になりますプログラム。 図1に、核はマウスから解剖され、分析される側坐核れ…

Discussion

行動パラダイム以下の脳組織からの遺伝子発現の特徴付けは、成功によって異なります。行動パラダイムの間のマウスの1）慎重な取り扱い;目的の組織の2）迅速かつ正確な解剖; RNAの完全性を確保するための3）RNAセーフ対策; 4）慎重なプライマーと実験レイアウトの計画だけでなく、qPCR分析の準備のために細部にまで精度と注意。

記載された手順の目的は、行動の経験?…

Materials

Virusol	Oriek Medical	J29D
Isoflurane, USP 100%	MINRAD INC	NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit	QIAGENE	73404
QIAshredder	QIAGENE	79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit	Invitrogene	AB-4368814
TE Buffer	Invitrogene	1355656
Behaviour Chamber (MDF; 50X45cm)	Self assembled
Inner Perspex box (30X30cm)	Self assembled
camera and video recorder	Campden Inst	CMD-80051
Media Recorder software	Noldus	NDS-NMR3-00M
Iris Scissors	FST	FST-14062-09
Sagital Brain slicer with a 0.5mm section	Brain Tree Scientific	BS-AL-505S
Bioanalyzer	Agilent Technologies	The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler	Bio-Rad	1852048
Inverted microspun spatula	Bochem Instrument GmbH	3213
Biomark HD Reader	Fluidigm	BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96gene expression	Fluidigm	BMK-M-96.96