Omfattande Analys av transkription Dynamics från Brain Prover Efter Behavioral Experience

Summary

This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.

Abstract

Kodningen av upplevelser i hjärnan och konsolideringen av varaktiga minnen beroende gentranskription. Identifiera funktionen av specifika gener i kodning erfarenhet är ett av de viktigaste målen för molekylär neurovetenskap. Dessutom den funktionella sammanslutning av definierade gener med specifika beteenden har konsekvenser för att förstå grunden för neuropsykiatriska störningar. Induktion av robusta transkriptionsprogram har observerats i hjärnan hos möss efter olika beteende manipulationer. Medan vissa genetiska element används återkommande efter olika beteende manipulationer och i olika hjärnkärnor, transkriptions program är totalt unika för inducerande stimuli och strukturen där de studerade ^1,2.

I denna publikation är ett protokoll beskrivs för robust och omfattande transkriptions profilering från hjärnkärnor hos möss som svar på beteende manipulation. Denprotokoll demonstreras i samband med analys av genuttryck dynamiken i nucleus accumbens efter akut kokainupplevelse. Efter en definierad in vivo erfarenhet, målet nervvävnad dissekeras; följt av RNA-rening, omvänd transkription och användning av mikroflödes matriser för omfattande qPCR analys av flera mål gener. Detta protokoll är inriktad omfattande analys (adresse 50-500 gener) att begränsa mängder utgångsmaterial, såsom små hjärnprover eller till enskilda celler.

Protokollet är mest fördelaktiga för parallell analys av flera prover (t.ex. enskilda celler, dynamisk analys efter läkemedels, virus eller beteendestörningar). Emellertid skulle protokollet också fungera för karakterisering och kvalitetssäkring av prover före hel-genomstudier av mikromatriser eller RNAseq, samt validering av uppgifter från hel-genomstudier.

Introduction

Hjärnans dynamisk organisation möjliggör kognitiv och beteende flexibilitet. Erfarenheter kodas genom ändringar i strukturen och styrka kopplingar mellan nervceller i hjärnan ^3. Denna "erfarenhet beroende plasticitet" är resultatet av induktion av specifika mönster av genuttryck som ger de nödvändiga proteinerna för modifiering av synaptiska struktur och styrka ^4. Identifieringen av genreglerande nätverk medierar bildandet av långvariga minnen är en central grundsats i molekylär neurovetenskap, med förväntningen att identifieringen av de dominerande inslagen i transkription program kommer att ge insikt i de grundläggande principer som reglerar minnesbildning, samt mål för behandling av neurodegenerativa och neuropsykiatriska störningar. Transkription program utvecklas i tidsmässigt definierade vågor, som var och en kodar gener av olika karaktär, som är viktiga för different etapper i genomförandet av resultatet av signalerings händelsen ^1,2. Därför är det viktigt att ta itu med transkription dynamiken på en detaljerad tidstidsskala, för att identifiera den full uppsättning av gener som induceras, och få insikt i deras potentiella funktion enligt dynamiken i deras induktion.

Drogberoende är en robust form av erfarenhet beroende plasticitet som orsakas av långvariga effekter av droger av missbruk på neurala kretsar i hjärnan ^5,6. Initial, akut exponering för läkemedel kan leda till utveckling av missbruk och övergången till kronisk användning. Kontextuell information som är av avgörande betydelse för utvecklingen av beroende. Narkotika tillhörande miljö ledtrådar delas stor betydelse i medvetandet hos missbrukare. Kontextuell information som påminner en missbrukare av tidigare drog erfarenhet kan framkalla återfall till drogbegär även efter långa perioder av avhållsamhet från läkemedelsexponering ^7,8.Därav den stora kliniska utmaningen i missbruk – benägenhet missbrukare till återfall även långt efter utsättningssymtom har avtagit ^9.

Behavioral sensibilisering för kokain är en enkel modell av kokain erfarenhet användbar i studiet av mekanismer för narkotikamissbruk. I denna vida studerad modell för långvarig allergi inducerad av kronisk exponering för droger av missbruk, är gnagare först vana vid saltinjektioner (ip, IP) i en ny miljö (ett öppet fält kammare där deras rörelseaktivitet övervakas) ; då får de dagliga injektioner av kokain i de öppna fältkammare medan deras aktivitet övervakas ¹⁰ (Figur 1). Denna beteende paradigm resulterar vanligtvis i en robust sensibilisering av rörelsebeteende (8-12 gånger över baslinjen aktivitet) ^11, som upprätthålls under en period av månader efter avslutad kokaininjektioner, visar bildandet av en pervasive minne spår av narkotika upplevelse.

Den neurala kretsar av belöning, naturligt involverad i att förstärka beteenden viktiga för att lyckas med en art (t.ex. utfodring, kön), utnyttjas av missbruksdroger att förstärka narkotikarelaterade beteenden ^12,13. De molekylära och cellulära mekanismer som upplevelsen av missbruksdroger förstärks tycks likna de mekanismer som ligger bakom bildandet av deklarativa eller semantiska minnen i andra hjärnstrukturer ^14. Därför robustheten i beteende sensibilisering modellen gör det till ett attraktivt modellsystem för att studera mekanismer erfarenhet beroende plasticitet.

Nucleus accumbens (NAC) är en central integrator av hjärnans belöningskretsarna, och har i stor utsträckning i samband med utveckling av missbruk ^5,6. Bildningen av missbruk beror på transkription av nya proteiner i nucleus accumbens, och robust iduktion av tydligt strukturerade transkriptionsprogram observeras i NAC efter kokainupplevelse ^15-19. Den akuta transkription svar på exponering kokain sannolikt fungera på flera nivåer för att anpassa sig till den starka induktions stimulans och för att styra produktionen av nya proteiner som ansvarar för de strukturella och elektrofysiologiska förändringar inducerade av exponering för läkemedlet ^6,19-22.

För att främja studier av molekylära mekanismer erfarenhet beroende plasticitet i hjärnan, är ett protokoll som beskrivits för omfattande analys av transkriptions dynamik i hjärnvävnadsprover efter beteende manipulation. Protokollet illustreras i samband med beteende erfarenhet studeras i Citri labb – beteendesensibilisering mot kokain, som utnyttjar mikrofluid dynamiska matriser för transkriptionell analys. Protokollet som beskrivs är naturligtvis inte begränsad till att studera tHan nucleus accumbens i samband med beteende sensibilisering, men kan tillämpas på ett stort antal beteende paradigm och hjärnan. I själva verket kan detta protokoll tillämpas på kroppsvävnader utanför hjärnan, och en mängd olika upplevelser eller manipulationer av organismen studerade.

Protokollet är grovt indelas i fyra steg. I det första steget, är djuret utsattes för beteendeparadigm; i det andra steget vävnaden är microdissected; i det tredje steget – mRNA renas, omvänd-transkriberades och sonderades, och i det sista steget av data analyseras.

I samband med att studera transkription dynamik, den exakta tidpunkten och definition av upplevelsen är förmodligen de viktigaste experimentella parametrar som styr. Av denna anledning är det av beteendesensibilisering mot kokain, ett system, som möjliggör hög nivå av försöksledaren kontroll över parametrarna i experien vår beteendemodell av valce. Ytterligare beteende paradigm som gör att exakta tidpunkten och behandlar olika modeller av erfarenhet beroende plasticitet eller minnesbildning finns. Dessa modeller inkluderar rädsla konditione ^23, akut miljöberikning ^24,25, nya objekt prospektering ²⁶ och visuell upplevelse efter mörka uppfödning ^27. Ändå beteende sensibilisering mot kokain är ett genomgående robust beteende manipulation, vilket skapar en mycket genomgripande minne spår som varar i månader efter kokain erfarenhet ^28.

Hjärnan är uppställd, följt av manuell microdissection av nucleus accumbens. Det har varit vår erfarenhet att manuell microdissection från snabbt beredda hjärnan skivor ger den mest pålitliga och snabb metod för att extrahera den vävnad som är relevant för beteendeparadigm, och med erfarenhet, gränserna för vävnaden blivit uppenbart och lätt igenkännbar. Alternativt kan fina skivor vara prepared, följt av laser-capture microdissection. Även om denna metod möjliggör skarp avgränsning av det intressanta området, är det lugnt (därmed riskera förlust av labila mRNA), tråkiga och kräver kostsamma dedikerade maskiner (ett mikroskop utrustat med en laser-capture setup). Protokollet definieras häri kan också anpassas till encelliga transkriptions analys genom manuell aspiration av cytoplasma visuellt identifierade celler genom att använda patch pipetter ^29. Det är viktigt att notera att det protokoll som beskrivs ger en befolknings genomsnittet, medan det är mycket troligt att det i de flesta fall endast en subpopulation av cellerna i vävnaden som faktiskt deltar i att svara på upplevelsen. Det är av intresse att profilera transkription på ett selektivt sätt inifrån specifika cellpopulationer som svarade på erfarenhet, men diskussioner om dessa metoder är utöver den nuvarande omfattningen.

För mRNA-rening, omvänd-transkription och qPCR fråge, vävnadenstörs genom att passera fina nålar, följt av användning av kommersiellt tillgängliga kit (för mer information, se tabell 8). Valet informeras av erfarenhet av dessa metoder, som säkerställer tillförlitlig utvinning av hög kvalitet RNA och robusta resultat från senare led.

Medan protokoll beskrivs för high-throughput qPCR utnyttjar dynamiska matriser, kan proverna undersökas för genuttryck med end-point PCR, låg genomströmning qPCR, genuttryck microarrays eller djup sekvensering. Den preferens för hög genomströmning qPCR utnyttjar dynamiska matriser beror på att mRNA som erhållits från hjärnkärnor efter beteende paradigm är ofta begränsande mängder. Dynamiska matriser ger en plattform som möjliggör effektiv övergripande analys av transkript från ett stort antal parallella prov i ett enda experiment. Efter den initiala förvärvet av mikroflödessystem (vanligen en institutionell purchase), experiment är relativt billiga att köra. Efter denna analys kan ytterligare fråge av proven utföras med dyrare plattformar för att söka efter nya transkript (av microarrays eller RNAseq) med de dynamiska matriser ger en omfattande referens för kvalitetssäkring. Slutligen, för dataanalys, är vanliga metoder utnyttjas. Särskilda tips om vilka frågor som kan uppstå kommer att diskuteras i texten av protokollet.

Detta protokoll är mest lämpliga för utredarna är intresserade av en grundlig utredning av sina system av intresse, som studerar flera villkor och replikat. Protokollet är också bäst för utredare som redan har finslipat i (genom microarray eller RNAseq experiment) på en delmängd av 50-500 gener av intresse, som de är intresserade av att fråga flera gånger.

Protocol

OBS: Protokollet följer riktlinjerna djur hand om Hebrew University i Jerusalem. 1 Beredning av ACSF lösning Bered ACSF lösning som beskrivs i tabell 1. Gör ett L i DDH 2 O (> 18 Mohm renhet), att föra osmolaritet till ~ 300 mOsm / L med lämplig tillsats av vatten eller NaCl. 2 Utrustning och Room Set Up Utrustning för övervakning av kokain-inducerad rörelsebeteende består av bet…

Representative Results

Kvaliteten på de resultat som fås genom detta protokoll beror ytterst på ett antal parametrar. Ordentlig försöksplanering kommer att resultera i minimal störning för de experimentella möss, så att beprövad erfarenhet (i detta exempel att exponering för kokain) kommer att vara den mest dominerande erfarenheten i sin moderna historia, och därför kommer att resultera i en robust och specifik transkriptions program. Figur 1 beskriver experimentell plan för beteende sensibilisering mot kokain, …

Discussion

Framgångsrik karakterisering av genuttryck från hjärnvävnad efter beteende paradigm beror på: 1) Noggrann hantering av möss under beteende paradigm; 2) Snabb och exakt dissektion av vävnad av intresse; 3) RNA-safe åtgärder för att säkerställa integriteten av RNA; och 4) Noggrann planering av primers och experimentell layout samt precision och känsla för detaljer som förberedelse för qPCR analys.

Syftet med det förfarande som beskrivs är att karaktärisera dynamiken i transk…

Materials

Virusol	Oriek Medical	J29D
Isoflurane, USP 100%	MINRAD INC	NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit	QIAGENE	73404
QIAshredder	QIAGENE	79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit	Invitrogene	AB-4368814
TE Buffer	Invitrogene	1355656
Behaviour Chamber (MDF; 50X45cm)	Self assembled
Inner Perspex box (30X30cm)	Self assembled
camera and video recorder	Campden Inst	CMD-80051
Media Recorder software	Noldus	NDS-NMR3-00M
Iris Scissors	FST	FST-14062-09
Sagital Brain slicer with a 0.5mm section	Brain Tree Scientific	BS-AL-505S
Bioanalyzer	Agilent Technologies	The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler	Bio-Rad	1852048
Inverted microspun spatula	Bochem Instrument GmbH	3213
Biomark HD Reader	Fluidigm	BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96gene expression	Fluidigm	BMK-M-96.96