Denne video artikel beskriver high throughput pipeline, som er blevet oprettet til at inficere og analysere store mængder af zebrafisk embryoner leverer et nyt stærkt værktøj til sammensatte test og lægemiddelforskning ved hjælp af et helt dyr hvirveldyr organisme.
Zebrafisk bliver et værdifuldt redskab i den prækliniske fase af lægemiddelforskning screeninger som en helhed dyremodel med high throughput screening muligheder. De kan bruges til at bygge bro mellem cellebaserede assays på tidligere stadier og in vivo validering i pattedyr modeller, reducerer på denne måde, at antallet af forbindelser, der passerer igennem til test på de meget dyrere gnavermodeller. På denne baggrund er i den nuværende manuskript beskrevet en ny high throughput rørledning ved hjælp af zebrafisk som in vivo model for studiet af Staphylococcus epidermidis og Mycobacterium marinum infektion. Denne opsætning giver mulighed for generering og analyse af et stort antal synkrone embryoner homogent inficeret. Desuden fleksibiliteten af rørledningen giver brugeren mulighed for nemt at gennemføre andre platforme for at forbedre opløsningen af analyse, når det er nødvendigt. Kombinationen af zebrafisk sammen med innovative high throughput technologies åbnes inden for drug test og opdagelsen af nye muligheder, ikke kun på grund af styrken ved at anvende et helt dyr model, men også på grund af det store antal af transgene linier til rådighed, der kan anvendes til at dechifrere virkningsmekanisme af nye forbindelser.
Til dato den zebrafisk (Danio rerio) er blevet oprettet som en effektiv model til at studere en række infektionssygdomme 1. Zebrafisk embryo tilbyder unikke in vivo billeddannelse muligheder på grund af deres gennemsigtighed og det store antal eksisterende transgene reporter linier udtrykker fluorescerende proteiner. Denne kraftfulde kombination gør det muligt at spore forskellige immun celletyper i tiden, mens interagere med patogener, såsom Mycobacterium marinum, den nærmeste slægtning til M. tuberkulose 2 eller Staphylococcus epidermidis, den vigtigste sygdomsfremkaldende af biomateriale associeret infektion 3-5. Forskellige smitteveje kan bruges i zebrafisk embryoner afhængigt henblik på undersøgelsen 6.
En af disse smitteveje er æggeblomme injektion af bakterier. Den væsentligste fordel ved denne metode i forhold til de andre, er, at blommen infectiden kan udføres automatisk via robot injektion, en markant reduktion injektionstiden og tillader høj reproducerbarhed af infektionen 7, 8.
Tidligere arbejde under anvendelse af zebrafisk som en high throughput in vivo-model-system til undersøgelse af S. epidermidis og M. marinum infektion viste sig at være en succes 7, 8. Dette system er i stand til at screene for sygdomsprogression via robot æggeblomme injektion af tidlige embryoner og bruge fluorescensudlæsning som en foranstaltning til den bakterielle belastning. I overensstemmelse med dette begreb har denne opsætning blevet optimeret og etableret en yderst effektiv high throughput pipeline med potentiale til at generere et stort antal af ensartet inficerede fostre og spore progression af infektion i tiden efter behandling med en række forbindelser. Med den etablerede setup er det muligt at generere op til 8.000 synkrone embryoner til at screenefor sygdomsprogression, behandling på denne måde op til 2.500 embryoner timen. Embryoer sorteret baseret på deres bakterieindhold ved hjælp af et automatiseret system, der sikrer homogene grupper af inficerede larver. Endvidere at validere setup, effekter af henvisningen kendt for at forebygge tuberkulose progression i pattedyr er blevet afprøvet på embryoer inficeret med M. marinum E11 stamme eller den mere ondartet M stamme 9.
Denne undersøgelse beskriver detaljeret high throughput rørledning, der er blevet fastslået at være i stand til at frembringe store antal inficerede embryoner og den efterfølgende analyse af den bakterielle progression under udviklingen og efter behandling med forbindelsen.
Den high throughput metode som beskrevet i dette papir giver en hurtig og omkostningseffektiv rørledning til at screene et stort antal af fisk embryoner og larver med forskellige typer af infektioner. Brug den store avl fartøj i stedet for de traditionelle enkelt-eller familiemæssige avl tanke lettet styring af gyde-processen og generering af større antal synkrone æg. Med en forbedret version af den automatiserede mikroinjektion systemet 7, er det muligt at tilføre op til 2.500 æg næsten alle i den samme celle stadiet inden for 1 time. Med disse opdateringer og forbedret software er det muligt at injicere flere æg end tidligere var muligt, som kan bruges til at udføre store narkotika skærme med bakteriel spredning som en læst op. Men denne metode er stadig begrænset til æggeblomme injektion, andre injektionssteder ruter for eksempel beskrevet af Benard et al. (2012) 6, vil forhåbentlig blive indarbejdet i den automatiserede mikro-indsprøjtningssystem i den nærmeste fremtid.
<p class = "jove_content"> Selv om disse metoder er benchmarkes til screening zebrafisk, ville det være nyttigt for applikationer med andre fiskearter så godt. For eksempel har den almindelig karpe blevet angivet til at have fordele for narkotika skærme. Ligesom zebrafisk, æg og embryoer fra almindelig karpe tidlige er gennemsigtige, men med den største fordel af sin store spawn størrelse hundrede tusinder af æg og tilgængeligheden af indavlede linjer, der tilbyder en mere konstant genetisk baggrund 16.Analysen af store mængder inficerede embryoner gøres med højt gennemløb store partikler flowcytometer. Denne enhed kan sortere analyseret embryoner i multi brøndplader eller en petriskål gør det særligt velegnet til at teste et stort antal forbindelser. Hvis der er behov højere billedbehandling opløsning, end opsætningen er tilpasset på en sådan måde, at den store partikel flowcytometret teknologi kan bruges til pre-screening og efterfølgende analysere prøverne ved et medium gennembragt i en højere opløsning. Dette kan gøres ved hjælp af hvirveldyr Automated Screening Technology 17, 18. Denne enhed kan automatisk indsamle levende eller faste fostre mellem 2 og 7 dage efter befrugtning fra en multi godt plade eller bulk container, billede 360 ° gennem en kapillær hjælp CLSM eller stereo mikroskopi og bortskaffes igen i 2 bulkcontainere tillader manuel sortering af embryonerne baseret de mikroskopiske billeder. Fremtidige forbedringer vil gøre det muligt for sortering af embryo efter billeddannelse i multi godt plade, derfor gør det muligt at screene automatisk stort antal individuelle embryoner over tid med CLSM. Antages det, at i fremtidige ansøgninger hvirveldyr Automatiseret Screening teknologisk system kan også være forbundet med store partikler flowcytometer teknologi uden behov for forudgående udlevering larver i multi-brønds plader, vil føre til en mere avanceret sortering.
Dette papir beskriver oprettelsen af end optimering af et high throughput setup til at studere S. epidermidis og M. marinum infektion som en model for lægemiddelforskning. Det viser, at resultatet af disse bakterier injiceret i blommen afhænger af udviklingsstadiet af æggene på tidspunktet for injektion. Injektion af M. marinum E11 på 16-128 celle stadie eller M stamme på 16-64 celle stadium fører til samme infektion mønster som caudalvenen injektion 2, 6.. Denne opsætning er dog ikke begrænset til udbredelsen af kun bakterielle patogener. Det blev vist før, at det er muligt at robotersvejsede injicere opløsninger, der indeholder DNA, RNA eller morpholinos for gensplejsning, over-ekspression og gen knock-down undersøgelser henholdsvis 13. Desuden blev det vist, at denne opsætning er også nyttig til undersøgelse af cancercelleproliferation og migration. Derfor er denne rørledning præsenterer en alsidig fremgangsmåde til screeninger med højt gennemløb af forskellige signal mekanismer i forbindelseaf medfødte immunitet, anvendt på smitsomme sygdomme og udvikling af kræft. Disse skærme kan kombineres med andre for medicin opdagelse, men også med analyse af mulige toksiske effekter af identificerede gældende narkotika.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Leonie de Boer og Bas Zaat (Academic Medical Centre) for at give os den S. epidermidis O-47-stamme. Vi takker Rico Bongaarts, Francis Smet og Angela Comas (Union Biometrica) for hjælp og rådgivning med Copas XL og VAST BioImager analyse. Vi takker Davy de Witt, Ulrike Nehrdich og Laura van Hulst for fisk bevogtning og andre kolleger fra Leiden University for nyttige diskussioner. Denne forskning er en del af projektet P5.03 IBIZA af forskningsprogrammet for Biomedicinske materialer institut, co-finansieret af det hollandske økonomiministerium, og Smart Mix Program (NWOA_6QY9BM) i Holland økonomiministerium og Det nederlandske ministerium for uddannelse, kultur og videnskab. Yderligere støtte blev opnået fra EU-projektet ZF-sundhed (FP7-Sundhed-2009 til 242.048), og RMJ blev støttet af Marie Curie-stipendium som erfaren forsker i EU grunduddannelsesnet FishForPharma (PITN-GA-2011-289209). SJR modtaget støtte fra initiativet om innovative lægemidler fællesforetagende under tilskudsaftale nr. 115337 anslåede, midler, som er sammensat af finansielle bidrag fra Den Europæiske Unions syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) og EFPIA selskaber i naturalier contribution.The forfattere anerkender endvidere økonomisk støtte fra Leiden University Fund (LUF) til robotteknik og fra Cyttron, i Besluit Tilskud Investeringen Kennisinfrastructuur program, som igen er støttet af den nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning for billeddannende. Systemet købet Den Copas blev delvist støttet af afdelingen for Jorden og Life Sciences (ALW) med finansiel støtte fra den nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO, 834.10.004).
Middlebrook 7H10 agar | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 262710 | |
Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 271310 | |
BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 211886 | |
BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 211887 | |
LB agar | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | L5542 | Multiple suppliers |
LB broth | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | L3022 | Multiple suppliers |
Chloramphenicol | Bio-connect, Huissen, the Netherlands | 16785.03 | Multiple suppliers |
Hygromycin | Bio-connect, Huissen, the Netherlands | 25966.01 | Multiple suppliers |
Tween-80 | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | P1754 | Multiple suppliers |
Polyvinylpyrrolidone40 | Calbiochem, San Diego, California, USA | 529504 | Multiple suppliers |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | A5040 | |
Agarose | Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands | S103 | Multiple suppliers |
Instant ocean sea salt | Sera Marin, Heinsberg, Germany | 5460 | |
iSPAWN | Techniplast, Buguggiate, Italy | iSPAWN | |
Automated microinjection system | Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands | Automated microinjection system | |
Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL) | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | COPAS XL | |
Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager) | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | VAST BioImager | |
LP Sampler | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | LP Sampler | |
Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS SL | |
Injection needle 10 µm inner diameter | Qvotek, Mississauga, Canada |