Denne videoen artikkelen beskriver high throughput rørledningen som har blitt etablert for å infisere og analysere store mengder sebrafisk embryo gir et nytt kraftig verktøy for sammensatte testing og medisiner ved hjelp av en hel dyr virveldyr organisme.
Sebrafisk er blitt et verdifullt verktøy i preklinisk fase av medisiner screenings som helhet dyremodell med høy gjennomstrømming screening muligheter. De kan brukes til å bygge bro mellom cellebaserte analyser på tidligere stadier og in vivo validering i pattedyrmodeller, noe som reduserer på denne måte, antallet forbindelser som passerer gjennom til testing på de mye dyrere gnager-modeller. I lys av dette, i den nåværende manuskriptet er beskrevet en ny høy gjennomstrømning rørledningen ved hjelp av sebrafisk som in vivo modellsystem for studier av Staphylococcus epidermidis og Mycobacterium marinum infeksjon. Dette oppsettet gjør at produksjon og analyse av store antall synkrone embryoer homogent smittet. Videre fleksibilitet av rørledningen lar brukeren enkelt implementere andre plattformer for å forbedre oppløsningen av analysen når det trengs. Kombinasjonen av sebrafisk sammen med innovative high throughput technologies åpnes innen legemiddeltesting og oppdagelse av nye muligheter, ikke bare på grunn av styrken ved bruk av en hel dyremodell, men også på grunn av det store antallet av transgene linjer som er tilgjengelige som kan brukes til å dechiffrere måten av nye forbindelser.
Hittil sebrafisk (Danio rerio) har blitt etablert som en effektiv modell for å studere en rekke smittsomme sykdommer en. Sebrafisk embryo tilbyr unik in vivo bildemuligheter på grunn av sin åpenhet og det store antall eksisterende transgene reporter linjer uttrykker fluorescerende proteiner. Denne kraftige kombinasjonen gjør det mulig å spore ulike immuncelletyper i tid mens samspill med patogener som Mycobacterium marinum, nærmeste slektning av M. tuberkulose 2 eller Staphylococcus epidermidis, den viktigste forårsakende av biomateriale assosiert infeksjon 3-5. Forskjellige ruter av infeksjon kan brukes i sebrafisk embryoer, avhengig av formålene med studien 6..
En av disse infeksjonsveier er eggeplomme injeksjon av bakterier. Den største fordelen med denne metoden i forhold til de andre er at eggeplomme infectiden kan utføres automatisk via robot-injeksjon, noe som reduserer innsprøytningstid og tillater høy reproduserbarhet av infeksjonen 7, 8.
Tidligere arbeid, ved hjelp av sebrafisk som en høy gjennomstrømning in vivo modellsystem for studier av S. epidermidis og M. marinum infeksjon viste seg å være vellykket 7, 8. Dette systemet er i stand til å screene for sykdomsprogresjon via robot plomme injeksjon av tidlige embryoer og med fluoresens avlesning som et mål for den bakteriemengde. I overensstemmelse med dette begrepet, og dette oppsettet er optimalisert og etablert en svært effektiv med høy gjennomstrømning rørledning med mulighet for å generere store mengder av homogent infiserte embryoer og spore progresjon av infeksjon i løpet av tiden etter behandling med et antall forbindelser. Med den etablerte oppsettet er det mulig å generere opptil 8000 synkrone embryoer til skjermenfor sykdomsutvikling, behandling på denne måten opp til 2500 embryoer per time. Embryoet er sortert basert på deres bakteriemengde ved hjelp av et automatisk system, som sikrer homogene grupper av infiserte larver. Videre, for å validere oppsett, effekter av referansen kjent for å forhindre tuberkulose progresjon hos pattedyr har blitt testet på befruktede egg infisert med M. marinum E11 belastning eller mer virulente M belastning ni.
Denne studie beskriver nærmere høy gjennomstrømning rørledningen som har blitt etablert for å være i stand til å generere et stort antall infiserte embryoer og den etterfølgende analyse av den bakterielle progresjon i løpet av utvikling og etter at forbindelsen behandling.
Den high throughput metoden beskrevet i denne artikkelen gir en rask og kostnadseffektiv rørledning til skjermen høyt antall fisk embryoer og larver med ulike typer infeksjoner. Ved hjelp av den store avl fartøy i stedet for tradisjonelle enkle eller familie avl tanker tilrettelagt kontroll av gyteprosessen og generering av større antall synkrone egg. Med en forbedret versjon av den automatiserte mikroinjeksjonssystemet 7, er det mulig å injisere opp til 2500 egg nesten alle i samme cellestadiet løpet av 1 time. Med disse oppdateringene og forbedret programvare er det mulig å injisere flere egg enn tidligere var mulig som kan brukes til å utføre store narkotika-skjermer med bakteriell spredning som en lese ut. Men denne fremgangsmåte er fortsatt begrenset til plomme injeksjon, andre injeksjonsruter for eksempel beskrevet av Benard et al. (2012) 6, vil forhåpentligvis innarbeides i den automatiserte mikroinjeksjonssystemet i nær fremtid.
<p class = "jove_content"> Selv om disse metodene er testet for screening sebrafisk, ville det være nyttig for applikasjoner med andre fiskearter også. For eksempel har den vanlig karpe blitt indikert å ha fordeler for narkotika-skjermer. Som sebrafisk, egg og tidlige embryoer fra karpe er gjennomsiktig, men med den viktigste fordelen med sin store gyte størrelsen på hundre tusenvis av egg og tilgjengeligheten av innavlede linjer som tilbyr en mer konstant genetisk bakgrunn 16.Analysen av store mengder av infiserte embryoer er gjort med høy gjennomstrømning stor partikkel strømningscytometer. Denne enheten kan liksom analysert embryoer i multibrønnplater eller en petriskål som gjør det spesielt egnet for testing av et stort antall forbindelser. Dersom en høyere avbildningsoppløsning som er nødvendig, enn konfigurasjonen er tilpasset på en slik måte at den store partikkel flowcytometer teknologi kan benyttes for å pre-filtrering, og deretter analysere prøvene i et mediumsatt på en høyere oppløsning. Dette kan gjøres ved hjelp av Vertebrate Automated Screening Technology 17, 18. Denne enheten kan automatisk samle inn levende eller faste embryoer mellom 2 og 7 dager etter befruktning fra en multi brønn plate eller bulk container, image 360 ° gjennom et kapillær hjelp CLSM eller stereomikroskopi og kast igjen i to bulkcontainere tillater manuell sortering av embryoene basert på de mikroskopiske bilder. Fremtidige forbedringer vil tillate sortering av embryoet etter avbildning i flerbrønnsplate, og derfor gjør det mulig å screene automatisk stort antall enkelt embryoer over tid med CLSM. Forutsatt at det i fremtidige søknader Vertebrate Automated Screening Technology Systemet kan også kobles til den store partikkel flowcytometer teknologi uten behov for før utlevering larver i multi brønners plater, vil føre til en mer avansert sortering.
Dette notatet beskriver etablering end optimalisering av en høy gjennomstrømning oppsett for å studere S. epidermidis og M. marinum infeksjon som modell for legemiddelforskning. Det viser at resultatet av disse bakteriene injisert i plomme avhengig av utviklingsstadiet av eggene ved tidspunktet for injeksjonen. Injisering M. marinum E11 på 16-128 cellestadiet eller M belastning på 16-64 cellestadiet fører til samme smittemønster som halevenen injeksjon 2, 6. Men dette oppsettet er ikke begrenset til spredning av bare bakterielle patogener. Det er vist tidligere at det er mulig å robotically injisere oppløsninger som inneholder DNA, RNA eller Morpholinos for transgenesis har over-ekspresjon og gene knock-down-studier, henholdsvis 13.. Videre ble det vist at dette oppsettet er også anvendelige for studium av cancer celleproliferasjon og migrasjon. Derfor er denne rørledningen presenterer en allsidig fremgangsmåte for høy gjennomstrømning skjermer av en rekke signal-mekanismer i sammenhengav medfødt immunitet, anvendt på smittsomme sykdommer, og til utvikling av kreft. Disse skjermene kan kombineres med andre for medisin-funnet, men også med analyse av mulige toksiske effekter av identifiserte aktuelle medikamenter.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige til Leonie de Boer og Bas Zaat (Academic Medical Centre) for å gi oss med S. epidermidis O-47 belastning. Vi takker Rico Bongaarts, Francis Smet og Angela Comas (Union Biometrica) for å få hjelp og råd med Copas XL og VAST BioImager analyse. Vi takker Davy de Witt, Ulrike Nehrdich, og Laura van Hulst for fisk omsorgsrelasjoner, og andre kolleger fra Leiden University for nyttige diskusjoner. Denne forskningen er en del av prosjektet P5.03 IBIZA av forskningsprogrammet av biomedisinsk Materials instituttet, co-finansiert av det nederlandske Ministry of Economic Affairs, og av Smart Mix Program (NWOA_6QY9BM) av Nederland Ministry of Economic Affairs og av Den nederlandske departementet for utdanning, kultur og vitenskap. Ekstra støtte ble innhentet fra EU-prosjektet ZF-helse (FP7-Helse-2009-242048), og RMJ ble støttet av Marie Curie Fellowship som erfaren forsker i EU Initial Training Network FishForPharma (PITN-GA-2011-289209). SJR fått støtte fra Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking henhold tilskuddsavtalen n ° 115337, ressurser som er sammensatt av økonomiske bidrag fra EUs sjuende rammeprogram (FP7/2007-2013) og EFPIA selskaper ytelser contribution.The forfatterne videre innforstått økonomisk støtte fra Leiden University fondet (LUF) for robotikk og fra Cyttron, i Besluit Subsidier Investeringen Kennisinfrastructuur program, som igjen er støttet av den nederlandske organisasjonen for Scientific Research for bildebehandling fasiliteter. Den Copas system oppkjøpet ble delvis støttet av Divisjon for Jorden og biovitenskap (ALW) med økonomisk støtte fra den nederlandske organisasjonen for Scientific Research (NWO, 834.10.004).
Middlebrook 7H10 agar | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 262710 | |
Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 271310 | |
BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 211886 | |
BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 211887 | |
LB agar | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | L5542 | Multiple suppliers |
LB broth | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | L3022 | Multiple suppliers |
Chloramphenicol | Bio-connect, Huissen, the Netherlands | 16785.03 | Multiple suppliers |
Hygromycin | Bio-connect, Huissen, the Netherlands | 25966.01 | Multiple suppliers |
Tween-80 | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | P1754 | Multiple suppliers |
Polyvinylpyrrolidone40 | Calbiochem, San Diego, California, USA | 529504 | Multiple suppliers |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | A5040 | |
Agarose | Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands | S103 | Multiple suppliers |
Instant ocean sea salt | Sera Marin, Heinsberg, Germany | 5460 | |
iSPAWN | Techniplast, Buguggiate, Italy | iSPAWN | |
Automated microinjection system | Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands | Automated microinjection system | |
Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL) | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | COPAS XL | |
Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager) | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | VAST BioImager | |
LP Sampler | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | LP Sampler | |
Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS SL | |
Injection needle 10 µm inner diameter | Qvotek, Mississauga, Canada |