Esperimenti di immunoprecipitazione SILAC rappresentano un potente mezzo per scoprire nuova proteina: interazioni proteina. Consentendo l'accurata quantificazione relativa abbondanza di proteine sia nel controllo e campioni di prova, veri interazione può essere facilmente distinto da contaminanti sperimentali e interazioni bassa affinità conservata attraverso l'uso di condizioni di buffer meno stringenti.
Proteomica quantitativa in combinazione con la purificazione immuno-affinità, SILAC immunoprecipitazione, rappresentano un potente mezzo per la scoperta di nuova proteina: interazioni proteina. Consentendo la precisa quantificazione relativa di proteine abbondanza sia nel controllo e campioni, veri interazioni possono essere facilmente distinti dai contaminanti sperimentali. Interazioni bassa affinità possono essere conservati mediante l'uso di condizioni di buffer meno stringenti e rimangono facilmente identificabili. Questo protocollo discute l'etichettatura di cellule di coltura tissutale con isotopi stabili amminoacidi marcati, trasfezione e immunoprecipitazione di un'affinità targhetta proteina di interesse, seguita dalla preparazione per la presentazione di un impianto di spettrometria di massa. Questo protocollo illustra poi come analizzare e interpretare i dati restituiti dal spettrometro di massa al fine di individuare partner cellulari che interagiscono con una proteina di interesse. Come esempio di questa tecnica è applicata a idenduare proteine di legame dei fattori di inizio della traduzione eucariotiche: eIF4AI e eIF4AII.
Un passo essenziale per comprendere la funzione delle proteine è l'identificazione delle relative proteine che interagiscono. Qualora tali proteine sono noti ci sono una serie di tecniche disponibili, ciascuno con i propri pregi e difetti. Questi includono il sistema del doppio ibrido di lievito, saggi tendina con proteina ricombinante, così come la depurazione tandem affinità o TAP-codifica 1, 2.
Una più recente aggiunta a queste tecniche è la combinazione di purificazione per affinità di una proteina di interesse da una linea cellulare di mammifero rilevante, seguita da spettrometria di massa quantitativa utilizzando marcatura isotopica stabile di amminoacidi in coltura cellulare (SILAC) 3. Questo ha dei vantaggi rispetto al lievito approccio del doppio ibrido in quella localizzazione cellulare e modificazioni post-traduzionali non siano disturbati, così come vantaggi rispetto tradizionale TAP di marcatura che è un approccio quantitativo piuttosto che qualitativo permettendo all'utente di readily distinguere non specificamente proteine interagenti e contaminanti, da fattori dell'ospite che si legano specificamente. Inoltre, come un campione è tipicamente analizzato tutto, piuttosto che bande proteiche come singoli, proteine di interesse non sono mascherati da simile migrazione di proteine su un gel, né hanno in genere bisogno di essere presente a livelli sufficienti per essere visibile dopo colorazione, portando a aumento del numero di proteine identificate con sicurezza 4.
Per dimostrare questa tecnica, fusioni GFP del fattore eucariotico traduzione iniziazione strettamente correlati eIF4AI e eIF4AII che la quota di oltre il 90% di identità aminoacidica sono stati studiati da SILAC-immunoprecipitazione proteomica quantitativa. EIF4AI umana e II sono stati clonati in pEGFP-C1 per formare una proteina di fusione GFP in cui è fusa all'N-terminale di eIF4A. Per evitare la necessità di generare linee cellulari stabili trasfezione transiente è stato usato per fornire questi costrutti di isotopi cellule 293T etichettati stabili.
<p class="Jove_content"> cellule sono state prima etichettato per due settimane in SILAC RPMI, seguita da trasfezione di DNA plasmidico codificante una proteina di interesse. Le cellule sono state lisate, la concentrazione proteica normalizzati, e la stessa quantità di lisato affinità purificato su agarosio anti-GFP. Uguali quantità di eluato sono stati poi combinati e sottoposti ad analisi LC-MS/MS. I risultati di questa analisi vengono poi elaborati per identificare alta proteina fiducia: proteina (Figura 1).SILAC immunoprecipitazione consente di individuare non solo le interazioni dirette, ma anche una bassa affinità o interazioni indirette con complessi proteici 4. Utilizzando questo sistema, eIF4AI e II immunoprecipitazioni permesso l'identificazione riproducibile e fiducioso del partner di legame primario eIF4G (isoforme I / II e III) 5, nonché le interazioni indirette con eIF4E, e numerosi componenti del complesso eIF3.
La strategia tendina SILAC qui descritto rappresenta un mezzo molto sensibili e potenti di rilevazione nuova proteina: interazioni proteiche, e inoltre permette la discriminazione rapida e semplice dei modelli vincolanti alterati tra i campioni strettamente connessi di interesse. In questo esempio, questa tecnica è stata utilizzata per studiare la proteina: proteina dei eIF4AI e eIF4AII proteine 6. A conoscenza dell'autore, questo è il primo studio in letteratura sfruttando l'utilità di proteomica SILAC indagare dell'interattoma cellulare di questi due isoforme di eIF4A.
L'approccio sopra descritto utilizza una GFP-tag e anti-GFP perline 9, 10 e quindi modifiche possono essere necessarie per ottenere questo approccio da utilizzare per una specifica proteina di interesse, per esempio se la variabile è posto N-o C-terminale di una proteina. Ove possibile, le macchie occidentali o test funzionali dovrebberoessere eseguita per rilevare legame di un noto proteina partner di interazione. Se una proteina non tollerare fusione con un tag GFP, altra marcatura o strategie a tendina sono stati applicati a pulldowns SILAC utilizzando sia gli altri tag (FLAG 11, biotina 12, STREP (propri dati, inedito)), oppure utilizzando anticorpi primari contro una proteina di interesse dove siRNA knockdown della proteina bersaglio fornisce un campione di controllo 13. Tali esperimenti sono stati descritti altrove in letteratura, ma in breve, punto 1 e passi 5,4-8 verrebbero applicate come sopra, con passaggi 2-5,3 modificati come appropriato per il sistema di espressione / tendina di scelta utilizzano gli ingressi uguali di proteine, come descritto nella passi 2,4-2,5. Poiché le fasi di quantificazione consentono proteine di legame non specifici per essere rimossi a livello di analisi, si raccomanda di omettere pre-incubazione con sfere di controllo, o lavaggi di sali per preservare proteina bassa affinità: interazioni proteina con una proteina di interesse . A ma nucleasiy essere inclusi o omessi da questo protocollo secondo le specifiche di un particolare esperimento. Ad esempio: come le proteine utilizzate in questo metodo sono RNA elicasi, RNasi cocktail è stato incluso nel protocollo per rimuovere interazioni indirette mediate attraverso l'RNA (passo 3.2). In alcuni casi, tuttavia, ci potrebbe essere beneficiano di esecuzione esperimenti paralleli con e senza nucleasi per identificare interazioni dipendenti acidi nucleici.
All'interno di questo protocollo, la commutazione di 'medium' e campioni "pesanti" negli esperimenti replicati si raccomanda di controllare la variazione introdotta da differenze nei media SILAC o la crescita delle cellule. Un controllo alternativo comporta la commutazione sequenziale di tutti e tre ('luce', 'medium', e 'pesante') media in esperimenti di replica. Mentre questo approccio è potenzialmente più rigoroso, aumenta la complessità dell'analisi, come in almeno una replica, una proteina di interesse will essere prodotto in 'leggeri' cellule marcate ed è quindi necessario distinguere tra proteine costantemente identificati in campioni 'leggeri' (contaminanti ambientali come cheratine), e quelli che sono arricchiti solo in campioni 'leggeri' quando si lega ad una proteina di interesse.
Mentre l'uso di dati quantificazione permette di discriminazione specifici da interazioni non specifiche attraverso l'uso di una soglia, inevitabilmente alcune interazioni originali può essere scartata. L'approccio di cui sopra è un metodo semplice e rapido per identificare proteine: interazioni proteiche che possono essere facilmente tentato da ricercatori con esperienza precedente con la spettrometria di massa, o l'analisi di grandi proteine: proteine set di dati di interazione. Per gli usi più questo è più che sufficiente per identificare nuove proteine di interesse. Ulteriori modifiche di questo approccio per contribuire a ridurre questa perdita di dati sono descritte altrove in letteratura e comprendono l'utilizzo di un prbiblioteca frequenza otein se noto proteine contaminanti per un insieme specifico di parametri sperimentali (linea cellulare, matrice perlina, condizioni di buffer) può essere escluso 10, 14. Tuttavia, a seconda dei parametri sperimentali, tuttavia, può essere necessario eseguire una serie di esperimenti di controllo per generare un proteoma tallone e questo può quindi aumentare sia il costo e la complessità di questo esperimento. Ulteriori informazioni su questa tecnica è disponibile sul sito www.peptracker.co.uk 14.
Va inoltre osservato che il protocollo sopra descritto comporta la miscelazione di campioni diverso etichettati al termine del processo di immunoprecipitazione (definito un Mixing dopo purificazione – esperimento SILAC MAP). Questo viene fatto come proteina: proteina si verificano in un determinato equilibrio 15. Va notato che altri gruppi hanno combinato questo approccio MAP SILAC descritto in questo protocollo con incubazione dei campioniprima pulldown (Purificazione Dopo miscelazione – PAM SILAC) per periodi di tempo diversi (20 min a 2 ore sono stati utilizzati in letteratura) 15, 16. Sulla base di quanto rapidamente un rapporto proteina scende verso 1:1 è possibile indagare qualitativamente affinità di legame e di definire proteine come proteine interagenti stabili o dinamici 15.
In sintesi, pulldowns SILAC rappresentano un mezzo molto potente per identificare proteine che interagiscono con una determinata proteina di interesse, in un ambiente fisiologicamente rilevanti. La tecnica può essere facilmente adattato ad una serie di strategie di purificazione diverse, permettendo la sua applicazione a qualsiasi proteina di interesse. Quantificazione dei risultati semplifica enormemente l'identificazione delle interazioni autentiche, e permette il rilassamento delle condizioni di buffer stringenti utilizzati per eliminare leganti non specifici, e conserva quindi le interazioni a bassa affinità. Come fino a tre campioni possono essere confrontati nel suddettostrategia, la tecnica ha chiari punti di forza in confronto differenze nel legame proteico tra diverse isoforme proteiche, proteine mutanti, o l'effetto degli inibitori farmacologici. Come intere fette di gel sono analizzati piuttosto che singole bande che macchia da Coomassie, il numero di proteine identificate ad alta fiducia sono in genere superiori a quelli individuati in un GST / TAP-pulldown standard e sperimentatore pregiudizi nella scelta proteine di interesse viene rimosso. La tecnica confronta quindi molto favorevolmente con altre tecniche comunemente utilizzate utilizzate nella identificazione di nuove proteine-interazioni (lievito 2-ibridi, GST / His o TAP pulldowns).
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Wellcome Trust e BBSRC a IG. IG è un Wellcome Senior Fellow.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Dundee Cell Products | LM010 | DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine) |
Dialysed FBS (10kDa cutoff) 500ml | Dundee Cell Products | DS1003 | |
Arginine (R0) 25g | Sigma-Aldrich | A8094 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R6) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CLM-2265 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R10) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-539 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Lysine (K0) 25g | Sigma-Aldrich | L8662 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K4) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | DLM-2640 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K8) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-291 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Penicillin-Streptomycin, Liquid. 100ml | Gibco | 15140-122 | |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
GFP-trap Agarose (500μl resin) | Chromotek | gta-20 | |
5x SDS Sample loading buffer | Fisher Scientific | PN39000 | The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination. |
Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
BCA protein assay kit (1L) | Pierce | 23225 | |
Tris (Trizma) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Rnase cocktail | Ambion | AM2286 | |
NP-40 alternative | Millipore | 492016 |