SILAC Immunutfällningsexperiment utgör ett kraftfullt medel för att upptäcka nytt protein: protein interaktioner. Genom att låta den exakta relativa kvantifiering av protein överflöd i både kontroll-och testprover, sanna växelverkan lätt kan skiljas från experimentella föroreningar, och låg affinitet interaktioner bevaras genom användning av mindre stränga buffertförhållanden.
Kvantitativa proteomik i kombination med immunaffinitetsrening, SILAC immunoprecipitation, utgör ett kraftfullt medel för upptäckten av nytt protein: protein interaktioner. Genom att låta den exakta relativa kvantifiering av protein överflöd i både kontroll-och testprover, kan sanna växelverkan lätt kan skiljas från experimentella föroreningar. Låg affinitet interaktioner kan bevaras genom användning av mindre stringenta buffertbetingelser och vara lätt identifierbara. Detta protokoll diskuterar märkning av vävnadsodlingsceller med stabila isotopmärkta aminosyror, transfektion och immunfällning av en affinitet taggade protein av intresse, följt av förberedelser för att överlämnas till en mass anläggning spektrometri. Detta protokoll diskuterar sedan hur man kan analysera och tolka data som returneras från masspektrometer för att identifiera cellulära samarbetspartners interagerar med ett protein av intresse. Som ett exempel av denna teknik appliceras på identifiera proteiner som binder till de eukaryota translationsinitierings faktorer: eIF4AI och eIF4AII.
Ett viktigt steg i att förstå proteiners funktion är att identifiera relevanta interagerande proteiner. Om sådana proteiner är okända finns det ett antal tekniker tillgängliga, alla med sina egna förtjänster och nackdelar. Dessa inkluderar jäst två-hybridsystemet, neddragsvideokällor analyser med hjälp av rekombinant protein, samt tandem affinitetsrening eller TAP-märkning 1, 2.
Ett nyare Utöver dessa tekniker är en kombination av affinitetsrening av ett protein av intresse från en relevant cellinje från däggdjur, följt av kvantitativ masspektrometri med användning av stabil isotopmärkning av aminosyror i cellkultur (SILAC) 3. Detta har fördelar över jäst-två-hybridansats i den cellen lokaliseringen och posttranslationella modifieringar inte störs, såväl som fördelar jämfört med traditionella TAP märkning i det att den är en kvantitativ snarare än kvalitativ metod så att användaren kan reaDily skilja ospecifikt interagerande proteiner och föroreningar, från värdfaktorer som binder specifikt. Vidare, som ett prov är normalt analyseras helhet, snarare än som enskilda proteinband, proteiner av intresse är inte maskeras av liknande sätt migrera proteiner på en gel, och inte heller behöver de oftast att närvara vid tillräckliga nivåer för att vara synliga efter färgning, vilket leder till ökat antal tryggt identifierade proteiner 4.
För att demonstrera denna teknik, GFP fusioner av den närbesläktade eukaryota translationsinitiering faktor eIF4AI och eIF4AII som andel över 90% aminosyraidentitet undersöktes genom SILAC-immunoprecipitation kvantitativa proteomik. Humant eIF4AI och II klonades in i pEGFP-C1 för att bilda ett fusionsprotein där GFP är fuserad till N-terminalen av eIF4A. För att undvika behovet av att generera stabila cellinjer transient transfektion användes för att avge dessa konstruktioner till stabila isotopmärkta 293T-celler.
<p class="Jove_content"> Celler första märkta för två veckor i SILAC cellodlingsmedium, följt av transfektion av plasmid-DNA som kodar för ett protein av intresse. Cellerna lyserades sedan, proteinkoncentrationen normaliseras, och lika stora mängder av lysat affinitetsrenades på anti-GFP-agaros. Lika mängder eluat kombinerades sedan och lämnas in för LC-MS/MS analys. Resultaten av denna analys behandlas sedan för att identifiera högt förtroende protein: protein-interaktioner (figur 1).SILAC immunoprecipitation möjliggör identifiering av inte bara direkta interaktioner utan även låg affinitet eller indirekt interaktion med proteinkomplex 4. Med detta system eIF4AI och II immunoutfällningar tillåten reproducerbar och säker identifiering av den primära bindningspartnern eIF4G (isoformema I / II och III) 5, liksom indirekta interaktioner med eIF4E, och många komponenter i eIF3 komplex.
Den SILAC neddragningsstrategi som beskrivs här utgör ett mycket känsligt och kraftfullt sätt att upptäcka nytt protein: protein interaktioner, och dessutom gör det snabbt och enkelt diskriminering av förändrade bindningsmönster mellan närbesläktade prover av intresse. I detta exempel är denna teknik användes för att undersöka protein: protein-interaktioner för eIF4AI och eIF4AII proteiner 6. Till författarens kunskap, är detta den första studien i litteraturen utnyttja nyttan av SILAC proteomik för att undersöka den cellulära interactome av dessa två isoformer av eIF4A.
Den metod som beskrivs ovan använder en GFP-tagg och anti-GFP pärlor 9, 10 och därför modifieringar kan krävas för att denna metod ska användas för ett specifikt protein av intresse, till exempel om taggen är placerad vid N-eller C-terminalen av ett protein. Om möjligt, Western blotting eller funktionella analyser börutföras för att detektera bindning av en känd proteininteraktion partner. Om ett protein inte tolerera fusion med en GFP-tagg, annan märkning eller neddragsvideokällor strategier har tillämpats på SILAC drag med användning av båda andra taggar (FLAG 11, biotin 12, STREP (egna data, opublicerad)), eller genom användning av primära antikroppar mot ett protein av intresse där siRNA knockdown av målproteinet ger ett kontrollprov 13. Sådana försök har beskrivits på andra ställen i litteraturen, men i korthet, steg 1 och steg 5,4-8 skulle tillämpas som ovan, med steg 2-5,3 modifierade såsom är lämpligt för expression / pulldown system för val med hjälp av lika stora protein ingångar, såsom beskrivs i steg från 2,4 till 2,5. Eftersom kvantifieringen stadierna tillåta icke-specifika bindande proteiner tas bort på analysnivå, rekommenderas att utelämna förinkubation med kontrollkulor eller höga salt tvättar för att bevara låga affinitet protein: protein interaktioner med protein av intresse . En nukleas may inkluderas eller utelämnas detta protokoll i enlighet med detaljerna i ett visst experiment. Till exempel: när de proteiner som används i denna metod är RNA helikaser var RNas cocktail med i protokollet för att ta bort indirekt interaktion som förmedlas via RNA (steg 3,2). Men i vissa fall kan det vara nytta av att köra parallella experiment med och utan nukleas att identifiera nukleinsyra beroende interaktioner.
Inom detta protokoll är omkoppling av "medium" och "tunga" prover i upprepade experiment rekommenderas att kontrollera för variation infördes av skillnader i SILAC media eller celltillväxt. En alternativ styrning innebär sekventiell växling av alla tre ("lätt", "medium" och "tunga") media i replika experiment. Även denna metod är potentiellt strängare, det ökar komplexiteten i analysen, som i åtminstone ett replikat, ett protein av intresse wsjuk produceras i light märkta celler och därför är det nödvändigt att skilja mellan proteiner konsekvent identifierats i light prover (miljögifter såsom keratiner), och de som bara är anrikade i light prover när bundet till ett protein av intresse.
Samtidigt som användningen av kvantifiering uppgifter medger diskriminering av specifika-från icke-specifika interaktioner med användning av en tröskel, oundvikligen några äkta interaktioner kan kasseras. Tillvägagångssättet ovan är en enkel och snabb metod för att identifiera protein: protein interaktioner som lätt kan försök av forskare utan tidigare erfarenhet av masspektrometri, eller analys av stora protein: protein interaktionsdatamängder. För de flesta användningar är detta mer än tillräckligt för att identifiera nya proteiner av intresse. Ytterligare modifieringar av denna metod för att bidra till att minska denna förlust av data beskrivs på andra ställen i litteraturen och inkluderar användningen av en protein frekvens bibliotek där kända kontaminerande proteiner för en specifik uppsättning av experimentella parametrar (cellinje pärla matris, buffertförhållanden) kan uteslutas 10, 14. Emellertid, beroende på de särskilda experimentella parametrar kan det vara nödvändigt att köra ett antal kontrollexperiment för att alstra en vulst proteomet och detta kan därför öka både kostnaden och komplexiteten av experimentet. Ytterligare information om den här tekniken är tillgänglig från www.peptracker.co.uk webbplats 14.
Det bör också noteras att den ovan beskrivna protokollet inbegriper blandning olika märkta proverna vid slutet av immunutfällning processen (benämnd en blandning efter Rening – MAP SILAC experiment). Detta görs som protein: protein interaktioner inträffa vid en viss jämvikt 15. Det bör noteras att andra grupper har kombinerat detta MAP SILAC tillvägagångssätt beskrivs i detta protokoll med inkubation av provernaföre-neddragning (Rening Efter blandning – PAM SILAC) under olika lång tid (20 min till 2 h har använts i litteraturen) 15, 16. Baserat på hur snabbt en proteinhalt sjunker mot 1:01, är det möjligt att kvalitativt undersöka bindningsaffiniteter och definiera proteiner som stabila eller dynamiska samverkande proteiner 15.
Sammanfattningsvis SILAC pulldowns utgör ett mycket kraftfullt medel för att identifiera proteiner som interagerar med ett visst protein av intresse, i en fysiologiskt relevant miljö. Tekniken kan mycket enkelt anpassas till ett antal olika strategier för rening, vilket gör dess tillämpning på varje givet protein av intresse. Kvantifiering av resultaten förenklar avsevärt identifiera äkta interaktioner, och tillåter uppmjukning av stränga buffertförhållanden som används för att avlägsna icke-specifika bindemedel, och därmed bevarar låg affinitet interaktioner. Eftersom upp till tre prover kan jämföras i den ovanstrategi, har tekniken klar styrka i att jämföra skillnader i proteinbindningsgraden mellan olika proteinisoformer, muterade proteiner, eller effekten av farmakologiska hämmare. Som hela gelskivor analyseras snarare än enskilda band som fläcken genom Coomassie, antalet proteiner som identifierats vid högt förtroende är oftast högre än de som identifierats i en standard GST / TAP-pulldown, och försöksledaren partiskhet i valet proteiner av intresse avlägsnas. Tekniken jämför därför mycket positivt med andra vanliga tekniker som används i identifiering av nya protein-interaktioner (jäst 2-hybrid, GST / His eller TAP pulldowns).
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats med bidrag från Wellcome Trust och BBSRC till IG. IG är en Wellcome Senior Fellow.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Dundee Cell Products | LM010 | DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine) |
Dialysed FBS (10kDa cutoff) 500ml | Dundee Cell Products | DS1003 | |
Arginine (R0) 25g | Sigma-Aldrich | A8094 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R6) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CLM-2265 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R10) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-539 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Lysine (K0) 25g | Sigma-Aldrich | L8662 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K4) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | DLM-2640 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K8) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-291 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Penicillin-Streptomycin, Liquid. 100ml | Gibco | 15140-122 | |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
GFP-trap Agarose (500μl resin) | Chromotek | gta-20 | |
5x SDS Sample loading buffer | Fisher Scientific | PN39000 | The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination. |
Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
BCA protein assay kit (1L) | Pierce | 23225 | |
Tris (Trizma) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Rnase cocktail | Ambion | AM2286 | |
NP-40 alternative | Millipore | 492016 |