Глютамин поток изображений, используя Генетически кодируемые сенсоры
Summary
Эта статья покажет, как контролировать динамику глютамина в живых клетках с помощью волнуйтесь. Генетически кодируемые сенсоры позволяют мониторинг в реальном времени биологических молекул на субклеточном резолюции. Экспериментальное проектирование, технические детали экспериментальных установок, и соображения для пост-экспериментального анализа будут обсуждаться на генетически кодируемых сенсоров глютамина.
Abstract
Генетически кодируемые сенсоры позволяют мониторинг в реальном времени биологических молекул на субклеточном резолюции. Огромное разнообразие таких датчиков для биологических молекул стали доступны в последние 15 лет, некоторые из которых стали незаменимыми инструментами, которые обычно используются во многих лабораториях.
Один из интересных приложений генетически кодируемых датчиков является использование этих датчиков при исследовании процессов клеточного транспорта. Свойства перевозчиков, таких как кинетики и подложки специфики могут быть исследованы на клеточном уровне, обеспечивая возможности для камерного типа конкретных анализов транспортной деятельности. В этой статье мы покажем, как динамика транспортера можно наблюдать с помощью генетически закодированного датчик глютамина в качестве примера. Экспериментальное проектирование, технические детали экспериментальных установок, и соображения для пост-экспериментального анализа будут обсуждаться.
Introduction
Из-за значительного прогресса в области технологий, что позволяет экспертизу транскриптома и протеома на клеточном уровне, то сейчас она стала ясно, что биохимия и результирующий поток метаболитов и ионов весьма сотового типа конкретных. Например, в печени млекопитающих, последовательный деградация глутамина и синтез проводят одновременно по перипортальных клеток и клеток перивенозной соответственно, подача аммоний в цикле мочевины в первом типе клеток, потребляя избытка аммиака в последнем 1-3. В некоторых случаях, значительная биохимическая гетерогенность обнаруживается даже в одном "типа клеток" 4, 5. В дополнение к такому пространственной специфичности, клеточные уровни метаболитов и ионов высокой динамичностью (например, сигнальных молекул, таких как Са 2 + и циклических нуклеотидов). Пространственно-временные закономерности метаболитов и ионов часто играют важную роль в передаче сигнала. Ммониторинг функционирования клеточных динамику метаболитов и ионов, однако, представляют уникальную проблему. Во многих случаях изменение концентрации быстрый и временный, примером которого случае сигнальных молекул, таких как Ca 2 +, который распадается в течение ~ 20 мс в дендритных шипов 6. Кроме того, компартментализация биохимических путей в рамках и среди клеток затрудняет количественную динамику метаболитов и ионов с использованием экстракции и хроматографии на колонке / методы масс-спектрометрии.
Генетически кодируемые сенсоры для биологических молекул в настоящее время широко используется в связи с высокой пространственно-временной резолюции, которая позволяет экспериментатор изучать короткоживущие и / или обособленных молекулярной динамики (обзор в 7, 8). Эти генетически закодированные датчики можно условно разделить на две категории; датчики интенсивности основе и ratiometic датчики. Датчики интенсивности на основе, как правило, состоят из связывающего домена и гриппаorescent белок (FPS), и растворенное вещество связывания с связывающего домена изменяет интенсивность флуоресценции. Ratiometic датчики, с другой стороны, часто пользуются Фостер резонансный перенос энергии (FRET) между двумя ФП, которые функционируют как пара волнуйтесь. Эти датчики состоят из связывающего домена и двух ФП, и растворенное вещество связывания вызывает изменение эффективности FRET между двумя ФП. Большое количество датчиков для биологически важных метаболитов и ионов были разработаны в последнее десятилетие 8, 9.
Один из захватывающих возможности, предлагаемые таких генетически кодируемых сенсоров является их использование в анализе с высоким разрешением процессов мембранного транспорта, который ранее не был легко обнаружить на клеточном уровне. Генетически кодируемые сенсоры облегчить анализ транспортных механизмов, таких как субстратной специфичности и рН зависимости 10, 11. Кроме того, в сочетании с генетическими разрешенииources таких как библиотека РНК-интерференции конструкции для модельных организмов, в настоящее время можно проводить обыски генома для новых транспортных процессов с использованием генетически закодированные датчиков. Действительно, использование генетически закодированного датчика приводят к открытию ранее неохарактеризованных перевозчиков в нескольких случаях 12, 13.
В последнее время наша лаборатория разработала серию FRET основе датчика для глутамина. Мы показали, что уровни глютамина сотовой могут быть визуализированы с помощью таких FRET глютамина датчики 10. Эти датчики состоят из FRET донора (mTFP1), вставленной в бактериальную обязательного глютамин белка glnH, и FRET акцептора (Венера) на С-концах glnH (рис. 1). FRET эффективность этих датчиков уменьшить при связывании глутамина, в результате уменьшения отношения интенсивностей акцептор / доноров. Изысканные регулирование глютамин транспортных процессов играет важную роль в биологических процессах, таких как neurotransmission 14, 15 и содержание цикла мочевины в печени 1, 16, 17.
Здесь мы показываем, методологию анализа транспортной деятельности с FRET датчиков для глутамина, используя широким полем флуоресцентного микроскопа настройки. Цель экспериментов, представленных здесь, чтобы обнаружить транспортера деятельность в одной ячейке и изучить субстрата специфику временно выраженной транспортера.
Protocol
Representative Results
Discussion
Успех экспериментов изображений зависит от нескольких важных факторов. Одним из таких факторов является сродство датчиков используются, как описано выше. Абсолютная концентрация субстрата в субклеточном компартменте интерес, однако, часто неизвестно. Поэтому мы рекомендуем попробо?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH грант 1R21NS064412, NSF гранта 1052048 и Джеффресс Мемориал Целевой грант J-908.
Materials
| Inverted fluorescent microscope | Olympus | IX81F-3-5 | An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also appropriate. |
| Exitation filter (mTFP1) | Omega Optical | 3RD450-460 | band width 450-460 nm |
| Exitation filter (Venus) | Chroma | ET500/20 | band width 490-510 nm |
| Emission filter (mTFP1) | Chroma | HQ495/30m | band width 475-505nm |
| Emission filter (Venus) | Chroma | ET535/30m | band width 520-550nm |
| Dichroic mirror (FRET channels) | Chroma | 470dcxr | long pass, 470nm cut off |
| Dichroic mirror (YFP channel) | Chroma | 89002bs | passes 445-490nm, 510-560nm, 590-680nm |
| mCherry filter set | Chroma | 49008 | excitation 540-580nm, long pass dichroic with 585nm cut off, emission filter 595-695nm |
| Light source | Olympus | U-LH100L-3-5 | LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended |
| CCD camera | Qimaging | Rolera-MGi EMCCD | |
| apochromatic fluorescence objective | Olympus | ||
| perfusion system, ValveBank II | AutoMate Scientific | [01-08] | Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work |
| Laminar-flow chambers | C&L Instruments | VC-MPC-TW | Other larminar-flow chambers would also work |
| Chambered slide | Lab-Tek | 154534 | For open-chamber experiments |
| perfusion pump | Thermo Scientific | 74-046-12131 | For open-chamber experiments |
| Software supporting ratiometric measurements | Intellegenent Imaging Innovation | Slidebook 5.5 | |
| Laminar flow biosafety cabinet | ESCO | LA-3A2 | |
| Isotemp CO2 Incubator | Thermo Scientific | 13-255-25 | |
| Dulbecco's MEM (DMEM) | Hyclone | SH30243.01 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH3008703 | |
| penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I) | Invitrogen | 31985 | Used with Lipofectamine 2000 |
| Poly-L-Lysine solution | sigma | P4707 | |
| 25mm circular glass cover slips | Thermo Scientific | 12-545-102 | in case VC-MPC-TW is used |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Other transfection reagents can also be used |
| Solution A (Hank's buffer) | – | – | 9.7g HANK salt (Sigma H1387), 0.35g NaHCO3, 5.96g HEPES to 1L, pH adjusted to 7.35 with NaOH |
| Solution B | Solution A + 0.04mM Gln | ||
| Solution C | Solution A + 0.2mM Gln | ||
| Solution D | Solution A + 1mM Gln | ||
| Solution E | Solution A + 5mM Gln | ||
| Solution F | Solution A + 5mM Ala |
Referências
- Haussinger, D. Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle. Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).
- Haussinger, D. Hepatic glutamine metabolism. Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).
- Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P. Hepatic glutamine metabolism. Nutrition. 18, 301-303 (2002).
- Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).
- Sasagawa, Y., et al. Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity. Genome Biol. 14, R31 (2013).
- Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines. Neuron. 33, 439-452 (2002).
- Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
- Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells. Chemical reviews. , 111-3666 (2011).
- Okumoto, S. Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors. Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).
- Gruenwald, K., et al. Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors. PLoS One. 7, e38591 (2012).
- Chaudhuri, B., et al. Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips. Plant Journal. 56, 948-962 (2008).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
- Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter. Science. , 326-147 (2009).
- Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light. Glia. 30, 64-73 (2000).
- Rothstein, J. D., Tabakoff, B. Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition. J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).
- Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes. J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).
- Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2. Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).
- Bröer, A., et al. The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux. J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).
- Wallace, D. J., et al. Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor. Nature. 5, 797-804 (2008).
- Haugh, J. M. Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring. Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PLoS One. 8, e57712 (2013).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).
- Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening. PLoS One. 6, e20114 (2011).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
- Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells. J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).
