차 쥐 신생아 심근 라이브 셀 이미징은 아데노 바이러스 다음과 렌티 바이러스 형질 도입은 공 초점 현미경 디스크를 회전시키는 사용
Summary
This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.
Abstract
그들은 쉽게 하나의 절차에 많은 수에서 고립 될 수 있기 때문에 기본 쥐 신생아 심근 세포는 체외 심장 혈관 연구의 기본에 유용합니다. 인해 현미경 기술의 발전으로는 세포에 대하여 최소한의 광독성 우려 실시간으로 세포 사건을 조사하는 목적으로 생균 이미지를 캡처하는 비교적 용이하다. 이 프로토콜은 세포의 특성을 조절하는 렌티 바이러스 및 아데노 바이러스 전달 다음 공 촛점 회전 디스크 현미경을 사용하여 기본 쥐 신생아 심근 세포 라이브 인터벌 영상을 촬영하는 방법에 대해 설명합니다. 바이러스의 2 종류의 애플리케이션이 쉽게 두 개의 다른 유전자에 대한 적절한 전달 속도 및 발현 수준을 달성 할 수있다. 잘 집중 생균 이미지는 오랜 기간 동안 안정을 유지 초점 현미경의 자동 초점 시스템을 사용하여 얻을 수있다. 이 방법을 적용, 외생 적 엔지니어의 기능일차 배양 된 세포에서 발현 에드 단백질은 분석 될 수있다. 또한,이 시스템은 siRNA를 사용을 통해뿐만 아니라 화학 조절제의 유전자의 기능을 검사하는 데 사용될 수있다.
Introduction
차 쥐 신생아 심근 긴 시험관 1에 심근 기능을 조사하는 데 사용되었다. 그들은 몇 가지 잘 설립 방법 2-4으로 쥐 새끼에서 분리하기 쉽다. 가장 일반적인 방법은 콜라게나 또는 이전의 세포 격리에 심장의 결합 조직을 소화 트립신을 사용합니다. 연구원은 또한 성인 설치류 5-8뿐만 아니라 신생아 마우스 9,10에서 심근 세포를 분리하는 방법을 개발했습니다.
이 프로토콜은 두 단계의 효소 분해 절차를 이용하는, 신생아 래트 새끼로부터 심근 세포를 분리하는 방법을 설명한다. 트립신은 처음 4 ° C에서 O / N을 사용하고, 37 ℃에서 다음 정제 된 콜라게나된다 4 ° C에서 트립신 O / N과 심장 조직의 배양은 따뜻한 효소 용액 2 연속 배양을 사용하는 방법에 비해 수확 세포에 필요한 단계를 줄일 수 있습니다. 또, 정제 된 CO를 이용하여llagenase 오히려 조 효소보다는, 로트 간 변동 따라서 향상된 재현성을 제공하고, 제거 할 수있다.
특정 단백질의 기능 연구는 종종 아데노 11-13 및 / 또는 14-16 렌티 바이러스를 이용하여 단백질 발현 시스템을 사용한다. [주의 메시지] 바이러스 생산 및 조작은 NIH의 지침에 따라 수행되어야한다.
아데노 바이러스는 숙주의 게놈에 통합되지 않습니다. 이는 분할 셀과 비 분할 세포를 포함하여 대부분의 세포 유형뿐만 아니라 일차 전지 및 확립 세포주에서의 형질 도입 매우 높은 효율을 갖는다. 이 아데노 바이러스 유전자 발현에 대한 신뢰할 수있는 벡터합니다. 아데노 바이러스 벡터에 의해 부호화 된 단백질의 높은 수준의 전달 다음 48 시간 내에 개발하고, 그들은 몇 주 동안 17 일을 지속 할 수있다. 그러나, 단백질 발현 아데노 바이러스를 사용하는 하나의 단점은 재조합 ADE의 개발novirus은 복잡하고 시간 소모적이다. 많은 연구자들은 재조합 유전자 발현에 lentiviruses에 의존 한 이유 단점은 부분적으로 설명합니다. 아데노 바이러스 구조와는 달리, 렌티 바이러스의 구조를 생성하는 것은 빠르고 쉽습니다. lentiviruses 전체적으로 모두 분할 및 비 – 분할 세포에서 아데노 바이러스 형질 도입의보다 낮은 효율을 가지고 있지만, 그들은 숙주 게놈에 통합 않는다. 결과적으로, 형질 도입 유전자의 발현은 아데노 바이러스에 비해 lentiviruses에 안정됩니다.
때문에, 현미경의 분야에서의 기술 진보로, 그것은 재조합 단백질을 발현하는 세포의 생균 이미지를 캡처하는 것이 훨씬 쉽다. 이도 취득 비디오 레이트 속도로 진정한 보유하고 있습니다. 이 조사는 관심의 단백질의 특정 변경이 기능적으로 실시간으로 세포에 영향을 미칠 방법을 결정 할 수 있습니다. 공 촛점 회전 디스크 현미경은 리브을위한 최적의 기술을 만드는 몇 가지 주요 기능을 가지고 있습니다전자 이미징 셀 (18, 19). 동시에 점 스캔 공 초점 현미경보다 훨씬 적은 레이저 파워를 이용하면서 요꼬 회전 디스크는, 훨씬 더 빠른 이미지 수집을 허용한다. 이러한 특징 모두는 레이저가 시료에 동시에 통과하는 다수의 구멍을 포함 촛점 스피닝 디스크에 기인한다. 획득 동안, 디스크 자체가 신속하고 지속적으로 18-20을 회전시킨다. 현미경의 자동 초점 시스템을 사용함으로써, 안정된 포커스는 장기간에 걸쳐 유지된다. 이 연구원은 잘 초점을 맞춘 라이브 셀 이미지를 촬영할 수 있습니다. 획득 된 영상을 동영상 파일로 재생됩니다. 이미지는 그러한 ImageJ에 21,22 피지 23, 또는 다른 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어로 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
신생아 쥐에서 분리 된 주요 심근 긴 체외에서 심근의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜은 처음 4 ° C에서 트립신 O / N로 소화 한 후 정제 된 콜라게나, 두 단계의 효소 소화 방법을 사용하여 쥐의 새끼에서 신생아 심근의 분리하는 방법을 설명합니다. 정제 된 콜라겐 분해 공정을 이용하는 하나의 장점은 효소의 동일 등급 모두 아이솔레이션을 위해 사용된다는 점이다. 따라…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Alengo Nyamay’antu and Dr. Ilse Timmerman for their advices about lentiviral packaging. This work is supported by an American Heart Association Scientist Development Grant 10SDG4170137.
Materials
| 1 scissors for decapitation | WPI | 501749 | Autoclave before use |
| 1 fine scissors for heart isolation and chopping | WPI | 14393 | Autoclave before use |
| 2 fine forceps (Dumont No. 5) | Sigma | F6521 | Autoclave before use |
| Three sterilized 10 cm plastic dishes | Sigma | CLS430165 | for hearts isolation |
| 3.5 cm glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C | for final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative. |
| 3.5 cm glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-0.17-14-C | for TIRF or high resolution image |
| Ethanol solution, 70 % (v/v) in water | Sigma | E7148 | |
| 2% gelatin | Sigma | G1393 | |
| One sterilized 10 cm plastic dish | Sigma | CLS430165 | for trypsinization |
| Aluminium foil | any brand | ||
| parafilm | Sigma | P7543 | |
| Two 10 cm plastic cell culture dish | Sigma | CLS430165 | for selection |
| Auto pipette | Drummond Scientific | 4-000-300 | for trituration |
| Cell counter | |||
| Cellometer, automated cell counter | nexcelom | to check and count cells | |
| Microscope and Hematocytometer | any brand | to check and count cells | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | invitrogen | 15250-061 | |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-19AIC | |
| incubating orbital shaker | Sigma | Z673129 | to shake heart tissue with collagenase at 37 C at 170-200 rpm |
| 10 mg/ml BrdU solution | BD Pharmingen | 550891 | |
| DMEM, High Glucose | invitrogen | 41965039 | Mix medium as indicated in the protocol and warm before use |
| MEM | invitrogen | 31095029 | Mix medium as indicated in the protocol and warm before use |
| Fetal Bovine Serum | invitrogen | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | invitrogen | 15140-122 | |
| Section 2 lentiviral transduction | |||
| three packaging plasmids | |||
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro | Clontech | 632183 | |
| Opti-MEM (serum-free medium) | invitrogen | 31985070 | |
| transfection reagent | |||
| polyethyleneimine“Max”, (Mw 40,000) – High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form) | Polysciences | 24765-2 | It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | substitute for PEI as transfection reagent |
| chloroquine | Sigma | C6628 | dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine. |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| 10 ml Luer-Lok syringe, sterilized | BD | 309604 | |
| 0.45 um filters | Sigma | F8677 | use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus. |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | dissolve in water and make 8mg/ml stock solution, then filter it to sterilize. |
| polyethylene glicol 6000 | Sigma | 81260 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Section 3 Adenoviral transduction | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Some 10 cm cell culture dishes | Sigma | CLS430165 | |
| 96-Well Microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile | BD Falcon | 353072 | for titration |
| Multichannel piptte, 10-100 ul, 8-channel | eppendorf | 3122 000.035 | |
| Section 4 live cell imaging | |||
| Spinning disk confocal microspopy | PerkinElmer | L7267000 | |
| a temperature controlled chamber | any brand | to keep temperature at 37 C | |
| a CO2 environmental system | any brand | optional to maintain CO2 concentration optimal | |
| Medium | |||
| CO2 Independent Medium, No Glutamine | invitrogen | 18045-054 | for long time time-lapse imaging |
| DMEM, High Glucose, HEPES, no Phenol Red | invitrogen | 21063-029 | for long time time-lapse imaging |
Referências
- Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).
- Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
- MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors. Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. The American journal of physiology. , 271-1250 (1996).
- Kaestner, L., et al. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp. 31 (31), (2009).
- Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. 28 (28), (2009).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology. Animal. 44, 45-50 (2008).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J Vis Exp. 79 (79), (2013).
- Kass-Eisler, A., et al. Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).
- Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).
- Metzger, J. M. . Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications. , (2003).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).
- Bonci, D., et al. Advanced’ generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo. Gene therapy. 10, 630-636 (2003).
- Murakami, M., et al. The FGF system has a key role in regulating vascular integrity. The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).
- Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy — a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).
- Adams, M. C., et al. A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells. Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).
- Wilson, T. Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols). 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. , (2010).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature. 9, 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. 32 (32), (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. 63 (63), 10-3791 (2012).
- Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J Vis Exp. 62 (62), 10-3791 (2012).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic acids research. 30, (2002).
- Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).
- McSharry, J., Benzinger, R. Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol ‘precipitation’. Virology. 40, 745-746 (1970).
- Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50. Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).
- Kaerber, G. . Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162. , (1931).
- Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance. Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).
- Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor. The Journal of biological chemistry. , 267-1470 (1992).
- Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors. Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).
- Murakami, M., et al. FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice. The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).
- Bazan, C., et al. Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes. Biophysical reviews. , 231-2310 (2012).
- Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts. The American journal of physiology. , 264-573 (1993).
