Studera DNA Looping med enda molekyl FRET
Summary
Denna studie visar en detaljerad experimentell procedur för att mäta looping dynamik dubbelsträngat DNA med användning av en enda molekyl fluorescensresonansenergiöverföring (FRET). Protokollet beskriver också hur man extrahera looping sannolikhetstätheten kallas J faktorn.
Abstract
Bockning av dubbelsträngat DNA (dsDNA) förknippas med många viktiga biologiska processer som DNA-protein erkännande och DNA-förpackning i nukleosomer. Termo av dsDNA böjning har studerats av en metod som kallas cyklisering som förlitar sig på DNA-ligas för att kovalent ansluta korta klibbiga ändar av en dsDNA. Däremot kan ligation effektivitet påverkas av många faktorer som inte är relaterade till dsDNA looping exempel DNA-strukturen som omger de sammanfogade klibbiga ändarna och ligas kan också påverka de looping hastigheten genom mekanismer som t.ex. icke-specifik bindning. Här visar vi hur man mäter dsDNA looping kinetik utan ligas genom att upptäcka övergående DNA slinga bildas genom FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA-molekyler är uppbyggda med hjälp av en enkel PCR-baserat protokoll med en FRET par och en biotin länkare. Repetitionssannolikhetstäthet känd som J faktorn extraheras från looping hastigheten och glödgning hastigheten mellan två frånkopplingted klibbiga ändar. Genom att testa två dsDNAs med olika inneboende krökningar, visar vi att J faktor är känslig för den inneboende formen av dsDNA.
Introduction
Förstå de mekaniska egenskaperna för dsDNA är av grundläggande betydelse i grundläggande vetenskaper och tekniska tillämpningar. Strukturen för dsDNA är mer komplicerad än en rak spiralstege eftersom rulle, tilt och twist vinklar mellan varandra baspar kan variera med sekvens. Termiska fluktuationer kan orsaka dsDNA att genomgå olika former av konformationsförändringar såsom böjning, vridning och stretching. Övergångar såsom smältning och veck kan också förekomma i extrema förhållanden.
Bland dessa motioner, har dsDNA böjning den mest märkbara biologiska effekter 1. dsDNA böjning är associerad med genen repression eller aktivering genom att två avlägsna platser nära varandra. Den spelar också en viktig roll i DNA-förpackningar inne i cellkärnan eller en viral kapsid. Böjning deformation av dsDNA kan visualiseras experimentellt genom högupplösande mikroskopi (AFM 2 och TEM 3) och thermodynamics och kinetik kan studeras genom att kretsa analyser, som är kemiskt länkar intill varandra belägna platser i dsDNA.
En sådan analys är ligasberoende cyklisering 4. I denna analys är dsDNA-molekyler med "klibbiga" (kohesiva) ändar cirkulariseras eller dimeriseras genom DNA-ligas. Genom att jämföra hastigheterna av cirkeln och dimerbildning kan man erhålla en effektiv molära koncentrationen av den ena änden av DNA i närheten av den andra änden, som är känd som J-faktor. Denna J faktor är dimensions ekvivalent med sannolikhetstätheten för att finna en änden av DNA på ett kort avstånd från den andra änden, och således återspeglar flexibiliteten hos DNA. Mätning av J faktorn som funktion av DNA längd avslöjar många egenskaper om DNA-mekanik inklusive persistens längd 4,5.
Den maskliknande kedja (WLC) modell har allmänt betraktas som den kanoniska polymer modell för dsDNA mekaniker som baseras på dess framgång i förklaringining de kraft-förlängningskurvor som erhållits i DNA drar experiment 6, och korrekt förutsäga J faktorer dsDNAs längre än 200 bp 7. Men med hjälp av cykliseringen analysen på dsDNA-molekyler så korta som 100 bp, Cloutier och Widom mätte J faktorer vara flera tiopotenser högre än WLC modellen förutsägelse 8. Ett år senare, Du et al. producerat J faktorer i samförstånd med WLC modellen med cykliseringssteget analysen med lägre koncentrationer av ligas och ges avvikande resultat från Widom gruppen för höga ligas koncentrationer som används 9. Denna kontrovers exemplifierar den oundvikliga påverkan av DNA-ligas på cykliseringsbetingelser kinetik när du använder den konventionella analysen 9. Dessutom kan DNA-ligas också påverka DNA-strukturen och stelhet genom icke-specifik bindning 10,11.
För att eliminera de tekniska frågorna för proteinberoende looping analyser, nyligen visade vi en protein fria looping analys baserad på fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) 12. I denna metod är slingkopplade konformationer detekteras av FRET mellan givaren och acceptorn fäst nära de klibbiga ändarna av en DNA-molekyl. Ett mål-typ total inre reflektion fluorescensmikroskop (TIRFM) används för att registrera banor av reversibel looping och unlooping händelser från yt-immobiliserade enstaka DNA-molekyler för en längre tid. Denna metod har PCR-baserad sammansättning av DNA-molekyler för att generera mismatch-free DNA-molekyler, vilket är en avgörande förbättring i förhållande till en liknande metod av Vafabakhsh och Ha 13. Den enda molekyl aspekt av detta protokoll möjliggör mätning av distributioner förutom ensemble genomsnitt medan FRET aspekten gör att man kan mäta DNA-looping dynamik upprepade gånger från samma molekyl, även i förhållanden som kan försämra ligas aktivitet.
Den TIRFM installationen visas i figur 1. En anpassadDesignade exemplar skede placeras över en Olympus IX61 mikroskopkroppen. 532 nm och 640 nm lasrar införs från sidan och reflekteras av små elliptiska speglar 14 i den höga NA målet att uppnå en kritisk infallsvinkel på täckglas-vatten-gränssnitt. Vi noterar att mer utbredd genom-mål TIR använder dikroitiska speglar eller prismabaserade TIR uppställningar kan också användas för detta FRET-applikation. Den fluorescensbild som bildas av mikroskopet är uppdelad i donator-och acceptor bilder genom en dikroisk spegel. De är sedan åter avbildas på två halvor av en EMCCD. Ytterligare långpassemissionsfilter används för att reducera bakgrundssignalen.
Temperaturreglering är nödvändig för att förvärva reproducerbara kinetiska data. För temperaturreglering, är målet separeras från nosdel av mikroskopkroppen för att minimera värmeöverföring, och vatten från en temperaturstyrd kylmaskin / värmare cirkuleras genom en mässings krage som tätt passarrunt det inre metallen under målet jacka. Denna inställning kan uppnå robust temperaturkontroll vid täckytan mellan 15 och 50 ° C (figur 2). I detta arbete var provtemperaturen hölls vid 24 ° C.
Följande protokoll visar steg-för-steg förfarande för DNA-konstruktion, uppskattning av DNA-form, enda molekyl experiment och J faktor bestämning.
Protocol
Representative Results
Discussion
En enkel enda molekyl analys baserad på FRET användes för att studera looping kinetiken för DNA: n från olika inneboende former. Böjda DNA: n kan beredas genom att upprepa en 10-mer-sekvens i fas med den spiralformade period av 10,5 bp och deras krökningar kan uppskattas med hjälp av PAGE. Dessa dsDNAs är utformade med klibbiga ändar för att tillåta övergående slinga stabilisering. Vi extraherade looping ränta från den exponentiella ökningen av antalet sling molekyler över tiden. Glödgningen hastighet…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar James Waters, Gable Wadsworth och Bo Broadwater för kritiskt läsa manuskriptet. Vi tackar också fyra anonyma granskare för att ge användbara kommentarer. Vi erkänner ekonomiskt stöd från Georgia Institute of Technology, den Burroughs Wellcome Fund Karriär Award på den vetenskapliga gränssnitt, och bidrags eleven forskningsnätverk från NSF fysik levande system.
Materials
| Small DNA FRAG Extract Kit-100PR | VWR | 97060-558 | |
| Acrylamide 40% solution 500 mL | VWR | 97064-522 | |
| Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 mL | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| Mini Vertical PAGE System | VWR | 89032-300 | |
| Syringe filter 0.2um CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | triplet state quencher |
| Protocatechuic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | oxygen scavenging system |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | oxygen scavenging system |
| mPEG-silane, MW 2000 1g | Laysan Bio | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Biotin-PEG-Silane, MW 3400 | Laysan Bio | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-540L | |
| Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit | IBI Scientific | IB47020 | |
| Premium plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR micro cover glass, rectangular, no. 1 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006s Recirculating Chiller/Heater | Fisher Scientific | temperature control | |
| Objective Cooling Collar | Bioptechs | 150303 | temperature control |
| KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage | Semprex | KMI53 | |
| High Performance DPSS Laser 532nm 50mW | Edmund optics | NT66-968 | Cy3 excitation |
| CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30mW, Fiber, FC/APC Connector | Coherent | 1139604 | Cy5 excitation |
| 650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter | Semrock | FF650-Di01-25×36 | splitting dichroic |
| LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm | Semrock | LM01-552-25 | combining dichroic |
| Brightline Fluorescence Filter 593/40 | Semrock | FF01-593/40-25 | Cy3 emission filter |
| 635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 emission filter |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 inverted microscope frame | Olympus | ||
| Objective UApo N 100x/1.49 Oil TIRF | Olympus | ||
| Immersion oil type-F for fluorescence microscopy | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated | Edmund optics | 54-092 | miniature mirror |
| 1/4" Travel Single-Axis Translation Stage | Thorlabs | MS-1 | translation of miniature mirror |
| Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | focusing lens |
| Adjustable Mechanical Slit | Thorlabs | VA100 | |
| Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E02 | |
| Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | relay lens |
| Lens Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | LMR1 | |
| Dichroic Filter Mount | Thorlabs | FFM1 | |
| Fixed Cage Cube Platform | Thorlabs | B3C | |
| Kinematic Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | collimating lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm | Thorlabs | LA1222-A | telescope lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm | Thorlabs | LA1433-A | telescope lens |
Referências
- Garcia, H. G., et al. Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity. Biopolymers. 85, 115-130 (2007).
- Wiggins, P. A., et al. High flexibility of DNA on short length scales probed by atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 1, (2006).
- Lionberger, T. A., et al. Cooperative kinking at distant sites in mechanically stressed DNA. Nucleic Acids Research. 41, 6785-6792 (2011).
- Shore, D., et al. DNA flexibility studied by covalent closure of short fragments into circles. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 4833-4837 (1981).
- Geggier, S., Vologodskii, A. Sequence dependence of DNA bending rigidity. Proc Nat Acad Sci U S A. 107, 15421-15426 (1992).
- Smith, S. B., et al. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Peters, J. P., Maher, L. J. DNA curvature and flexibility in vitro and in vivo. Quarterly Reviews of Biophysics. 43, 23-63 (2010).
- Cloutier, T. E., Widom, J. Spontaneous sharp bending of double-stranded DNA. Molecular Cell. 14, 355-362 (2004).
- Du, Q., et al. Cyclization of short DNA fragments and bending fluctuations of the double helix. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 5397-5402 (2005).
- Yuan, C., et al. T4 DNA ligase is more than an effective trap of cyclized dsDNA. Nucl. Acids Res. 35, 5294-5302 (2007).
- Manzo, C., et al. The effect of nonspecific binding of lambda repressor on DNA looping dynamics. Biophysical Journal. 103, 1753-1761 (2012).
- Le, T. T., Kim, H. D. Measuring shape-dependent looping probability of DNA. Biophys. J. 104, 2068-2076 (2013).
- Vafabakhsh, R., Ha, T. Extreme bendability of DNA less than 100 base pairs long revealed by single-molecule cyclization. Science. 337, 1097-1101 (2012).
- Friedman, L., et al. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical Journal. 91, 1023-1031 (2006).
- Kaplan, N., et al. The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome. Nature. 458, 362-366 (2009).
- Koo, H. S., Crothers, D. M. Calibration of DNA curvature and a unified description of sequence-directed bending. Proc Nat Acad Sci U S A. 85, 1763-1767 (1988).
- Prosseda, G., et al. A temperature-induced narrow DNA curvature range sustains the maximum activity of a bacterial promoter in vitro. Bioquímica. 49, 2778-2785 (2010).
- Rasnik, I., et al. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3, 891-893 (2006).
- Cordes, T., et al. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. J. Am. Chem. Soc. 131, 5018-5019 (2009).
- Aitken, C. E., et al. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
- Taylor, W. H., Hagerman, P. J. Application of the method of phage T4 DNA ligase-catalyzed ring-closure to the study of DNA structure: II. NaCl-dependence of DNA flexibility and helical repeat. Journal of Molecular Biology. 212, 363-376 (1990).
- Bolshoy, A., et al. Curved DNA without A-A: experimental estimation of all 16 DNA wedge angles. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 2312-2316 (1991).
- Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucl. Acids Res. 37, 6984-6990 (2009).
- Vologodskii, A., et al. Bending of short DNA helices. Artif DNA PNA XNA. 4, (2013).
- Hoover, D. M., Lubkowski, J. DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis. Nucl. Acids Res. 30, (2002).
- Waters, J. T., Kim, H. D. Equilibrium Statistics of a Surface-Pinned Semiflexible Polymer. Macromolecules. 46, 6659-6666 (2013).
- Mills, J. B., et al. Electrophoretic evidence that single-stranded regions of 1 or more nucleotides dramatically increase the flexibility of DNA. Bioquímica. 33, 1797-1803 (1994).
