공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서
Summary
조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.
Abstract
우리는 개발과 쥐의 골수 이식 실험 모델을 이용하여 생체 내 조혈에서 공부하는 높은 공간 및 시간 해상도와 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs)의 클론 추적을위한 방법론을 표시하는 형광을 확인. 형광 단백질 (fps)를 코딩하는 렌티 바이러스 벡터를 사용하여 표시하는 유전자 조합이 고급 현미경 영상을 통해 세포 운명 매핑 할 수있었습니다. 다섯 가지 FP의 인코딩 벡터 : 세룰 리안, EGFP, 금성, tdTomato 및 mCherry 컬러 표시 세포의 다양한 팔레트를 만드는 동시에 HSPCs를 형질 도입하는 데 사용되었다. 공 초점 / 두 광자 하이브리드 현미경을 사용하여 영상의 동시 고해상도 고유 표시 세포의 평가와 조직 구조 구성 요소와 함께 자신의 자손을 할 수 있습니다. 체적은 스펙트럼 적 부호화 HSPC 유래 세포는 비 침습적 골수 손상을 포함하는 다양한 조직에서 검출 될 수있는 것으로 나타났다 (큰 영역 위에 BM 분석), 이식 다음 시간의 광범위한 기간 동안. 4D 비디오 속도 광자 공 촛점 시간 경과 영상을 결합 라이브 연구는 정량적 인 방법으로 동적 세포 및 클론 추적의 가능성을 보여줍니다.
Introduction
혈액 세포, 조혈 지칭의 제조는, 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs)의 작은 집단에 의해 유지된다. 이러한 세포는 모두 자기 갱신 및 1,2 분화의 제어에 연루, 골아 세포, 간질 세포, 지방 조직, 혈관 구조로 이루어진 복합 미세 환경 틈새 골수 (BM) 내에 상주. 그대로 BM 직접 관찰 전통적으로 액세스 할 수없는 한 바와 같이, HSPC과 미세 환경 사이의 상호 작용은 생체 내에서 주로지지 않은 남아있다. 이전에, 우리는 공 초점 형광 및 반사 현미경 3를 사용하여 그대로 BM의 3 차원 구조를 시각화하는 방법을 설립했다. 우리는 BM-EGFP에 표시된 HSPCs의 확장을 특징으로하지만, 단지 하나의 FP 사용 클론 레벨에서 재생의 분석을 배제. 아주 최근에 우리는 구조적으로 FL을 표현 렌티 바이러스 유전자 존재론 (레고)의 장점 벡터를했다uorescent 단백질 수 (fps)을 효율적으로 세포 4,5를 표시합니다. 3 또는 5 벡터와 HSPC의 공동 형질이 여러 개인 HSPC 클론의 추적을 허용, 조합 색상의 다양한 팔레트를 생성합니다.
표시됨 HSPC는 조사 된 마우스의 BM 개별 HSPC 원점 복귀 및 생착를 추적하도록 허용 새로운 이미징 기술과 결합. 레고 벡터는 뼈와 기타의 명확한 시각화를 허용, (세루 리안, eGFP는, 금성, tdTomato 및 mCherry부터) 셋 또는 다섯 다른 FP의와 HSPC을 표시하고 공 촛점 및 2 광자 현미경에 의한 BM에서 시간이 지남에 따라 자신의 생착을 수행하는 데 사용 된 매트릭스 구조, 및 그 구성 요소의 미세 HSPC 클론 관계. HSPC 레고 벡터로 형질 C57BL / 6 마우스 BM의 계보 음성 세포로 정제하고, myelo – 절제 congenic 마우스로 꼬리 정맥 주사로 reinfused되었다. 흉골 BM 조직의 큰 볼륨을 모니터링함으로써 우리는 초기에 발생하는 골 내막 생착을 시각화BM 재생. 다양한 컬러 스펙트럼이있는 셀 클러스터는 뼈 가까이에 처음 등장하고 시간이 지남에 따라 중앙에서 진행. 흥미롭게도, 이상 삼주 후 골수 오히려 혈류를 통해 HSPCs 널리 보급보다 연속적으로 골수에서 개별 HSPCs에서 유래 조혈의 확산을 제안, 거시적 클론 클러스터로 구성되었다. 작은 색상의 다양성은 다수의 벡터와 세포를 다시 채우기 장기 열 변환하는데 어려움을 시사 늦은 시점에서 있었다.
또한 HSPCs는 마우스에서 비장에 대한 책임 또한 조혈 기관을 클러스터 형성. HPSC에서 파생 된 각각의 세포뿐만 아니라, 흉선에서 림프절, 비장, 간, 폐, 심장, 피부, 골격 근육, 지방 조직, 신장 해결 될 수있다. 3D 이미지는 조직의 최소한의 교란과 세포의 분포를 평가하는 정 성적 및 정량적으로 평가 될 수있다. 마지막으로, 우리는 설명공진 스캔 광자 공 촛점 시간 경과 영상을 결합하여 4D 라이브 동적 스터디의 개발 가능성. 이 방법론은 조직 재생 및 병리학의 연구에서 강력한 도구를 제공, 자신의 본래 3D 아키텍처 스펙트럼 표시 세포 인구의 비 침습적 높은 해상도, 다차원 세포 운명의 추적을 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 살아있는 조직에 메스하고 역동적 인 이미지를 달성하기 위해 직렬 공 촛점 및 2 광자 현미경 5FP 인코딩 레고 벡터와 영상으로 표시 조합에 의해 생성 된 큰 다양성을 결합, 여기에 최근 클론 세포 추적을위한 고안 강력한 방법의 세부 사항을 설명합니다. 이것은 5 "뚜렷한"8 비트 채널에서 촛점 스펙트럼 ID를 기록하여 마킹 FP 기반 컬러의 사용을 확장. 따라서 각 셀 내에서 세룰 리?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program of the National Heart, Lung, Blood Institute of the National Institutes of Health. We thank Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany) for providing the five LeGO vector plasmids; Christian A. Combs and Neal S. Young (NHLBI, NIH) for discussions, support and encouragement throughout this study, and Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) for assistance with tail vein injections.
Materials
| Production of viruses | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expression of Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expression of eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expression of Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expression of tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expression of mCherry |
| Calciumm Phosphate Transfection Kit | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Tissue culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma | F4135-500ML | |
| Pen Strep Glutamine | Gibco, Life Technology | 10378-016 | |
| Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22um) | Millipore | SLGS033SS | |
| Mouse cell collection, purification, transduction and transplantation | |||
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Lineage Cell Depletion Kit (mouse) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS columns + tubes | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Pre-Separation Filters (30um) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500mL) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | |
| recombinant murine SCF | RDI Division of Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | |
| recombinant murine IL-3 | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | |
| 12-well plates, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | |
| Protamine Sulfate | Sigma | P-4020 | |
| Confocal and two-photon microscopy | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well | Thermo Scientific | 155383 | |
| Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1080nm | Coherent | ||
| Chameleon Compact OPO laser range 1030-1350nm | Coherent | ||
| HCX-IRAPO-L 25x/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20x/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40x/1.1NA water immersion objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris software version 7.6 | Bitplane |
Referências
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