Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip
Summary
Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.
Abstract
Biz geliştirdik ve fare kemik iliği nakli deneysel model kullanılarak in vivo hematopozun incelemek için yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip hematopoetik kök hücrelerin (HSPCs) klonal takibi için metodoloji işaretleme floresan valide. Floresan proteinleri (FP) kodlayan Lentiviral vektörleri kullanılarak işaretleme Genetik kombinatoryel ileri mikroskopi görüntüleme yoluyla hücre kaderi haritalama etkin. Beş farklı FPS kodlayan vektörler: Shibuya, EGFP Venüs tdTomato ve MCherry renk işaretlenmiş hücrelerin çeşitli bir palet oluşturma, aynı zamanda HSPCs transdüksiyonu için kullanılmıştır. Konfokal / iki foton hibrid mikroskopi kullanılarak Görüntüleme aynı anda yüksek çözünürlüklü benzersiz işaretli hücrelerin değerlendirilmesi ve dokuların yapısal unsurları ile birleşik olarak da döl sağlar. Hacimsel spektral kodlu HSPC türetilmiş hücreler invasiv olmayan bir kemik iliği dahil olmak üzere çeşitli dokulara, tespit edilebilir olduğunu ortaya koymaktadır (büyük alanlar üzerinde analiz BM), Transplantasyon aşağıdaki kapsamlı bir süre için. 4D video hızı multiphoton ve konfokal time-lapse görüntüleme birleştirerek Canlı çalışmalar nicel bir şekilde dinamik hücresel ve klonal izleme olasılığını göstermektedir.
Introduction
Kan hücreleri olarak adlandırılan hematopoiezin üretimi, hematopoietik kök ve projenitör hücreleri (HSPCs) küçük bir nüfus tarafından muhafaza edilmektedir. Bu hücreler tüm kendini yenileme ve farklılaşma 1,2 kontrolünde rol, osteoblastlar, stromal hücreler, yağ dokusu ve vasküler yapılardan oluşan bir kompleks microenvironmental niş içinde kemik iliği (BM) içinde bulunur. Sağlam BM doğrudan gözlemlere geleneksel erişilemez olmuştur gibi, HSPC ve mikroçevresinin arasındaki etkileşimler in vivo ölçüde uncharacterized kalır. Daha önce, konfokal floresan ve yansıma mikroskobu 3 kullanılarak sağlam BM'nin 3D mimarisi görselleştirmek için bir metodoloji kurdu. Biz BM EGFP-işaretli HSPCs genişlemesi, özelliği, ancak yalnızca tek bir FP kullanımı klonal düzeyde rejenerasyonu tespiti engellemiştir. Çok yakın zamanda biz kurucu fl ifade Lentiviral Gen Ontoloji (Lego) yararlandı vektörleri aldıuorescent proteinler (FP) hücreleri verimli 4,5 işaretlemek için. 3 ya da 5 vektörlerle HSPC Co-transdüksiyon çoklu bireysel klonların HSPC izleme sağlayan, birleşik bir renk paleti çeşitli oluşturur.
İşaretli HSPC ışınlanmış farelerde BM bireysel HSPC homing ve bütünleşmesini izlemek için izin yeni görüntüleme teknolojisi ile birlikte. Lego vektörler kemik ve diğer açıkça görüntülenmesini sağlayan, (Cerulean, eGFP, Venüs, tdTomato ve mCherry itibaren) 3 veya 5 farklı aile hekimleri ile HSPC işaretlemek ve konfokal ve 2-foton mikroskopi BM zamanla kendi naklini takip etmek kullanıldı matris yapıları ve bunların mikro bileşenlerine HSPC klonların ilişkisi. HSPC lego vektörleri ile transduse edilmiş C57BL / 6 fareleri BM den soy negatif hücreleri gibi arıtıldı ve miyelo ablasyon konjenik farelerine kuyruk damarından enjeksiyon ile yeniden infüze edildi. Sternum BM doku büyük hacimli izleyerek biz erken meydana endesiteal bütünleşmesini görüntülendiBM rejenerasyon. Farklı renkli spektrumları ile hücre kümeleri kemiğe yakın ilk olarak ortaya çıktı ve zaman içinde merkezi olarak ilerledi. İlginç bir şekilde, en fazla 3 hafta sonra kemik iliği, kan akışı yoluyla oldukça yaygın HSPCs yayılması daha yakın olarak kemik iliğinde türetilen bireysel HSPCs hematopoez yayılmasını gösteren makroskopik klonal kümeleri oluşturmuştur. Daha az renk çeşitliliği çok vektörler ile hücrelerin repopulating uzun vadeli transduse güçlük göstermektedir de, geç zaman noktalarında oldu.
Buna ek olarak, HSPCs, dalakta farelerde hematopoez de sorumlu bir organ kümeleri oluşturmuştur. HPSC türetilmiş ayrı ayrı hücreler yanı sıra, timus, lenf düğümleri, dalak, karaciğer, akciğer, kalp, cilt, iskelet kas, yağ dokusu ve böbrek çözülebilirdi. 3D görüntüler dokuların en az değişimleri ile hücrelerinin dağılımını takdir nicel ve nitel olarak değerlendirilebilir. Son olarak, tasvirrezonans tarama multiphoton ve konfokal time-lapse görüntüleme birleştirerek 4D canlı dinamik çalışmaların d fizibilite. Bu metodoloji doku rejenerasyonu ve patoloji çalışmada güçlü bir araç sağlayarak, onların bozulmamış 3D mimarisi Işıksal işaretlenmiş hücreler nüfus non-invaziv, yüksek çözünürlüklü, çok boyutlu hücre kaderini izlemeyi sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz canlı dokularda hacimsel ve dinamik görüntüleme elde etmek için tandem confocal ve 2-foton mikroskopi ile 5FP kodlayan LEGO vektörler ve görüntüleme ile işaretleme kombinasyonal tarafından oluşturulan büyük çeşitliliğini birleştirerek, burada son zamanlarda klonal hücre izleme için tasarlanmış güçlü bir metodoloji ayrıntılarını anlatacağız. Bu 5 "farklı" 8-bit kanallarda confocal spektral kimliğini kaydederek işaretleme FP-tabanlı renk kullanımı genişletilmiş. Böylec…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program of the National Heart, Lung, Blood Institute of the National Institutes of Health. We thank Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany) for providing the five LeGO vector plasmids; Christian A. Combs and Neal S. Young (NHLBI, NIH) for discussions, support and encouragement throughout this study, and Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) for assistance with tail vein injections.
Materials
| Production of viruses | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expression of Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expression of eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expression of Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expression of tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expression of mCherry |
| Calciumm Phosphate Transfection Kit | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Tissue culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma | F4135-500ML | |
| Pen Strep Glutamine | Gibco, Life Technology | 10378-016 | |
| Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22um) | Millipore | SLGS033SS | |
| Mouse cell collection, purification, transduction and transplantation | |||
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Lineage Cell Depletion Kit (mouse) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS columns + tubes | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Pre-Separation Filters (30um) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500mL) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | |
| recombinant murine SCF | RDI Division of Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | |
| recombinant murine IL-3 | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | |
| 12-well plates, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | |
| Protamine Sulfate | Sigma | P-4020 | |
| Confocal and two-photon microscopy | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well | Thermo Scientific | 155383 | |
| Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1080nm | Coherent | ||
| Chameleon Compact OPO laser range 1030-1350nm | Coherent | ||
| HCX-IRAPO-L 25x/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20x/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40x/1.1NA water immersion objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris software version 7.6 | Bitplane |
Referências
- Lo Celso, ., C, D. T., Scadden, The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
- Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
- Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral ‘gene ontology’ (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
- Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
- Lo Celso, ., Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
- Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).
