Stofskiftesygdomme er blandt en af de mest almindelige sygdomme hos mennesker. Den genetisk medgørlig model organisme D. melanogaster kan anvendes til at identificere hidtil ukendte gener, der regulerer stofskiftet. Dette papir beskriver en forholdsvis enkel fremgangsmåde, som gør det muligt at studere stofskiftet i fluer ved at måle deres CO 2-produktion.
Stofskiftesygdomme er et hyppigt problem, der påvirker menneskers sundhed. Derfor forstå de mekanismer, der regulerer stofskiftet er en afgørende videnskabelig opgave. Mange sygdomsfremkaldende gener i mennesker har en flue homolog, at Drosophila en god model til at studere signalveje, der er involveret i udviklingen af forskellige lidelser. Derudover spores Drosophila forenkler genetiske skærme til at hjælpe med at identificere nye terapeutiske mål, der kan regulere stofskiftet. For at udføre en sådan skærm er nødvendigt med en enkel og hurtig metode til at identificere ændringer i metaboliske tilstand af fluer. I almindelighed kuldioxid produktion er en god indikator for substratoxidering og energiomsætning give oplysninger om metaboliske tilstand. I denne protokol indfører vi en enkel metode til at måle CO 2-output fra fluer. Denne teknik kan potentielt hjælpe med identifikationen af genetiske forstyrrelser, der påvirker stofskiftet.
Den biokemiske Krebs cyklus genererer ATP ved oxidering af acetat afledt fra kulhydrater, fedtstoffer og proteiner, der frembringer CO 2. I Drosophila, O 2-indgangen er direkte korreleret med CO 2-produktion og afspejler niveauet af stofskiftet 1. Således har måling af CO 2-udgang med succes været anvendt i undersøgelser i forbindelse med aldring og stofskifte 2-5. Her vores laboratorium har ændret tidligere designet forsøgsopstillinger, så måling af CO 2-produktionen i op til atten prøver uden at kræve nogen specialiseret udstyr. Andre, og vi har tidligere brugt denne metode til at vise forskelle i stofskifte i fluer, der er mangelfuld i muskelsvind protein, dystroglycan (DG) 6-8.
O 2 anvendes til oxidativ metabolisme omdannes til CO 2, der er udvist som respiratorisk affald. Opførelsention af håndlavede respirometers beskrives som giver mulighed for bestemmelse af hastigheden af O 2 forbruges. Fluerne anbringes i en forseglet beholder med et stof, der absorberer udvises CO 2, effektivt fjerne det fra gasfasen. Ændringen i gasvolumen (reduceret tryk) måles ved forskydning af væske i et glaskapillar fastgjort til den lukkede respirometer.
Den væsentligste fordel ved denne teknik i forhold til andre er omkostningerne. Tidligere undersøgelser har målt CO 2 produktion af Drosophila hjælp gas analysatorer og teknisk avancerede respirometri systemer 1,9. Trods en mere kompliceret udstyr, følsomheden af den her beskrevne fremgangsmåde svarer til rapporterede værdier (tabel 1). Derudover har en række andre grupper anvendes variationer af denne teknik til at bestemme relative stofskifte i Drosophila 4-6. Derfor kan dette assay anvendes til at frembringe reliable, reproducerbare relevante data for Drosophila stofskifte uden indkøb af specialudstyr, som kan være setup i enhver laboratorium og kan bruges til uddannelsesmæssige formål.
I almindelighed er de anerkendte teknikker til at bestemme metabolismen af en organisme er at måle produktionen af CO 2, O 2 forbruges, eller begge dele 3,4,9. Dog kan det antages, at en ækvivalent af O 2 genererer en ækvivalent af CO 2, den nøjagtige andel af CO 2 genereres, er afhængig af den metaboliske substrat udnyttet 10.. Således, at nøjagtigt at bestemme stofskiftet i energienheder er det nødvendigt at måle både O 2 forbruges og CO 2 produceres. På grund af dette, den her beskrevne fremgangsmåde er særlig relevant for at sammenligne forskelle i CO 2-produktion mellem dyr og ikke den absolutte værdi. Vores teknik integrerer flere dyr CO 2 produktion over en periode på time (1-2 timer), og derfor returnerer et gennemsnit af dyrenes aktivitet. Hvis der er grund til at tro, at forsøgsdyrene er mindre aktive end kontrol dyrene målingen kunne afspejle forskellige niveauer af aktivitet, og ikke nødvendigvis stofskifte.
I denne protokol, beskriver vi en billig og pålidelig metode til måling af CO 2 produktion i fluer. Vi fandt, at dette eksperiment er nem, hurtig at gennemføre og genererer reproducerbare data, der er i overensstemmelse med andre undersøgelser 1, 6, 9. Protokollen beskrevet her kan let ændres til at passe enhver laboratoriets budget og tilgængelige materialer. Opførelsen af enkelte respirometer kan tilpasses, så længe kammeret bliver utæt. Men jo længere, tyndere mikropipetter tilb…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Max-Planck Society for at finansiere vores forskning.
BlauBrand IntraMark 50µl micropipettes | VWR | 612-1413 | |
Soda Lime | Wako | CDN6847 | |
Eosine | Sigma | 031M4359 | Any dye that can create visible colorization of liquid can be used |
Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber | VWR | 21432-761 | Any transparent glass chamber that can be closed with the lid |
Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit | Flinn | FB1438 | |
Power Gel Glue | Pritt | ||
1 ml pipett tips | Any | ||
Foam | Any | ||
Plaesticine Putty | Any | ||
Scalpel | Any | ||
Twezzers | Any |