Misurazione del tasso metabolico in<em> Drosophila</em> Utilizzando respirometria
Summary
Disturbi metabolici sono tra una delle malattie più comuni negli esseri umani. Il modello di organismo geneticamente trattabili D. melanogaster può essere utilizzato per identificare nuovi geni che regolano il metabolismo. Questo documento descrive un metodo relativamente semplice, che permette lo studio del metabolismo in linea misurando la produzione di CO 2.
Abstract
Disturbi metabolici sono un problema frequente che colpisce la salute umana. Pertanto, la comprensione dei meccanismi che regolano il metabolismo è un compito scientifico fondamentale. Molti geni che causano malattie negli esseri umani hanno un omologo mosca, rendendo Drosophila un buon modello per studiare vie di segnalazione coinvolte nello sviluppo di malattie diverse. Inoltre, la trattabilità di Drosophila semplifica schermi genetici per aiutare a identificare nuovi bersagli terapeutici che possono regolare il metabolismo. Per eseguire tale schermata è necessario un metodo semplice e veloce per identificare le variazioni dello stato metabolico di mosche. In generale, la produzione di anidride carbonica è un buon indicatore di ossidazione del substrato ed il dispendio energetico fornire informazioni sullo stato metabolico. In questo protocollo si introduce un metodo semplice per misurare la CO 2 in uscita dalle mosche. Questa tecnica può potenzialmente aiutare nell'identificazione di perturbazioni genetiche che colpiscono tasso metabolico.
Introduction
Il ciclo di Krebs biochimico genera ATP attraverso l'ossidazione di acetato derivata dai carboidrati, grassi e proteine che producono CO 2. In Drosophila, O 2 ingresso è direttamente correlata con CO 2 uscita e riflette il livello di metabolismo 1. Così, la misurazione di CO 2 in uscita è stato usato con successo in studi legati all'invecchiamento e metabolismo 2-5. Qui il nostro laboratorio ha modificato apparati sperimentali progettati in precedenza, consente la misurazione della produzione di CO 2 fino a diciotto campioni senza bisogno di attrezzature specializzate. Altri e abbiamo già utilizzato questo metodo per mostrare le differenze nei tassi metabolici in linea che sono carenti nella distrofia muscolare proteina associata, distroglicano (DG) 6-8.
O 2 utilizzati per il metabolismo ossidativo è convertito in CO 2, che viene espulso come rifiuti respiratorio. La costruzionezione respirometri fatti a mano viene descritto che permette la determinazione del tasso di O 2 consumato. Mosche sono posti in un contenitore sigillato con una sostanza che assorbe espulso CO 2, eliminando efficacemente dalla fase gassosa. La variazione di volume di gas (diminuzione della pressione) è misurata dallo spostamento di liquido in un capillare di vetro attaccato alla respirometro chiuso.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri è il costo. Precedenti studi hanno misurato produzione di CO 2 da Drosophila utilizzando analizzatori di gas e sistemi di RESPIROMETRICO tecnicamente avanzati 1,9. Nonostante l'apparecchiatura più complessa, la sensibilità del metodo qui descritto è simile ai valori riportati (Tabella 1). Inoltre, diversi altri gruppi hanno utilizzato varianti di questa tecnica per determinare i tassi metabolici relativi in Drosophila 4-6. Pertanto, questo test può essere utilizzato per generare attendibilile, i dati riproducibili relativi al metabolismo Drosophila, senza l'acquisto di attrezzature specializzate che può essere installato in qualsiasi laboratorio e può essere utilizzato per scopi didattici.
In generale, le tecniche riconosciute per determinare il metabolismo di un organismo è misurare la CO 2 prodotta, l'O 2 consumato, o entrambi 3,4,9. Anche se, si può presumere che un equivalente di O 2 genera un equivalente di CO 2, il rapporto precisa del CO 2 generata dipende sul substrato metabolico utilizzato 10. Così, per determinare con precisione il tasso metabolico in energia è necessario misurare sia O 2 consumato e CO 2 prodotta. A causa di questo, il metodo qui descritto è specificamente rilevante per confrontare le differenze fra CO 2 produzione tra gli animali e non il valore assoluto. La nostra tecnica si integra aerei animale produzione di CO 2 per un periodo di time (1-2 ore) e quindi restituisce una media di attività degli animali. Se non vi è motivo di ritenere che gli animali sperimentali sono meno attivi rispetto agli animali di controllo la misura potrebbe riflettere i diversi livelli di attività e non necessariamente il metabolismo.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, si descrive un metodo poco costoso ed affidabile per misurare la produzione di CO 2 in mosche. Abbiamo trovato che questo esperimento è facile, rapida da condurre e genera dati riproducibile che è in accordo con altri studi 1, 6, 9. Il protocollo qui descritto può essere facilmente modificato per adattarsi bilancio e disponibili materiali di qualsiasi laboratorio. La costruzione di ogni singolo respirometro può essere adattato finché la camera rimane chiuso ermeticamente….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Max-Planck Society per finanziare la nostra ricerca.
Materials
| BlauBrand IntraMark 50µl micropipettes | VWR | 612-1413 | |
| Soda Lime | Wako | CDN6847 | |
| Eosine | Sigma | 031M4359 | Any dye that can create visible colorization of liquid can be used |
| Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber | VWR | 21432-761 | Any transparent glass chamber that can be closed with the lid |
| Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit | Flinn | FB1438 | |
| Power Gel Glue | Pritt | ||
| 1 ml pipett tips | Any | ||
| Foam | Any | ||
| Plaesticine Putty | Any | ||
| Scalpel | Any | ||
| Twezzers | Any |
Referências
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Physiol. 97, 1915-1922 (2004).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46, 1477-1480 (2000).
- van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Selected contribution: long-lived Drosophila melanogaster. lines exhibit normal metabolic rates. J Appl Physiol. 95, 2605-2613 (2003).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39, 1137-1143 (2004).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine modulates metabolic rate and temperature sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7, (2012).
- Takeuchi, K., et al. Changes in temperature preferences and energy homeostasis in dystroglycan mutants. Science. 323, 1740-1743 (2009).
- Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Magliarelli Hde, F., Shcherbata, H. R. Stress and muscular dystrophy: a genetic screen for dystroglycan and dystrophin interactors in Drosophila. identifies cellular stress response components. Biologia do Desenvolvimento. 352, 228-242 (2011).
- Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Wiek, R., Gopfert, M. C., Shcherbata, H. R. Hyperthermic seizures and aberrant cellular homeostasis in Drosophila dystrophic. muscles. Scientific Reports. 1, 47 (2011).
- Khazaeli, A. A., Van Voorhies, W., Curtsinger, J. W. Longevity and metabolism in Drosophila melanogaster: genetic correlations between life span and age-specific metabolic rate in populations artificially selected for long life. Genética. 169, 231-242 (2005).
- Elia, M. Energy equivalents of CO2 and their importance in assessing energy expenditure when using tracer techniques. The American Journal of Physiology. 260, (1991).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Bharucha, K. N. The epicurean fly: using Drosophila melanogaster. to study metabolism. Pediatric Research. 65, 132-137 (2009).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biology. 11, 38 (2013).
