Mätning av ämnesomsättning i<em> Drosophila</em> Med respiration

Summary

Metabola sjukdomar är bland en av de vanligaste sjukdomarna hos människor. Den genetiskt lätthanterlig modellorganism D. melanogaster kan användas för att identifiera nya gener som reglerar metabolism. Detta dokument beskriver en relativt enkel metod som gör det möjligt att studera den metaboliska hastigheten i flugor genom att mäta deras CO ₂ produktion.

Abstract

Metabola sjukdomar är ett vanligt problem som påverkar människors hälsa. Därför att förstå de mekanismer som reglerar ämnesomsättning är en viktig vetenskaplig uppgift. Många sjukdomar som orsakar gener hos människor har en fluga homolog, vilket gör Drosophila en bra modell för att studera signalvägar som är involverade i utvecklingen av olika sjukdomar. Dessutom, den spårbarhet Drosophila förenklar genetiska skärmar för att hjälpa till att identifiera nya terapeutiska mål som kan reglera ämnesomsättningen. För att kunna utföra en sådan skärm är det nödvändigt med en enkel och snabb metod för att identifiera ändringar i det metaboliska tillståndet hos flugor. I allmänhet är koldioxidproduktion en god indikator på substrat oxidation och energiförbrukning som ger information om metaboliskt tillstånd. I detta protokoll introducerar vi en enkel metod för att mäta CO ₂ som utmatas från flugor. Denna teknik kan potentiellt hjälpa till vid identifieringen av genetiska störningar som påverkar ämnesomsättning.

Introduction

Den biokemiska Krebs cykel genererar ATP genom oxidation av acetat som härrör från kolhydrater, fetter och proteiner som producerar CO _2. I Drosophila, O ₂ ingång är direkt korrelerad med _CO2-utgång och avspeglar graden av metabolism ^1. Således har mätning av _CO2-utgång med framgång använts i studier relaterade till åldrande och ämnesomsättning ^2-5. Här vårt laboratorium har ändrat tidigare utformade experimentella uppställningar, möjliggör mätning av CO _2-produktion i upp till arton proverna utan att kräva någon specialutrustning. Andra och vi har tidigare använt denna metod för att visa skillnader i metabola priser på flugor som har brist på det muskeldystrofi associerat protein, Dystroglycan (Dg) ^6-8.

O ₂ används för oxidativ metabolism omvandlas till CO _2, som drivs ut som andnings avfall. Byggning av handgjorda respirometers beskrivs som medger bestämning av graden av O ₂ konsumeras. Flugor placeras i en sluten behållare med ett ämne som absorberar utvisas CO _2, effektivt eliminera den från gasfasen. Förändringen i gasvolymen (nedsatt tryck) mäts genom förskjutning av fluid i en glaskapillär fäst vid den slutna respirometer.

Den största fördelen med denna teknik framför andra är kostnaden. Tidigare studier har mätt _CO2 produktion av Drosophila hjälp av gasanalysatorer och tekniskt avancerade respirometri system ^1,9. Trots den mer komplicerad utrustning, är känsligheten hos den här beskrivna metoden liknar rapporterade värden (tabell 1). Dessutom har flera andra grupper som används varianter av denna teknik för att bestämma relativa metabola priser i Drosophila ^4-6. Därför kan denna analys användas för att generera reliable, reproducerbara data med avseende på Drosophila metabolism utan inköp av specialutrustning som kan ställas in på något labb och kan användas i undervisningssyfte.

I allmänhet är de erkända metoder för att bestämma metabolismen av en organism är att mäta CO ₂ produceras, O ₂ konsumeras, eller både och ^3,4,9. Även om, kan det antas att en ekvivalent av O ₂ alstrar en ekvivalent av CO _2, varvid den exakta förhållandet av _CO2 som alstras beror på den metaboliska substrat utnyttjas ^10. Således är det nödvändigt att mäta både O ₂ konsumeras och CO ₂ produceras för att noggrant bestämma den metaboliska hastigheten i energienheter. På grund av detta, är den här beskrivna metoden är särskilt relevant för att jämföra skillnader i CO ₂ produktion mellan djur och inte det absoluta värdet. Vår teknik integrerar flera djur _CO2 produktionen under en period av Time (1-2 h) och därför återvänder ett genomsnitt av djurens aktivitet. Om det finns anledning att tro att försöksdjuren är mindre aktiva än kontrolldjuren mätningen kan återspegla olika aktivitetsnivåer och inte nödvändigtvis ämnesomsättning.

Protocol

1. Framställning av Respirometers Skär 1,000 l pipettspetsen med ett rakblad för att möjliggöra insättning av 50 ^ kapillär mikropipett, försöka få pipettspetsen så rakt som möjligt. Lägg en bit skum i pipetten och tryck ner den i pipettspetsen. Tillsätt en liten mängd CO2 absorberande och innehåller det genom en andra bit av skum. Applicera lim på den plats där mikropipett sätts in i pipettspetsen. Låt respirometer över natten för att l…

Representative Results

För att visa att metoden är känslig vi mätte CO2 produktion från vildtypen (Oregon R) män flyger på 18, 25 och 29 ° C och flyger mutant för Dg. Flugor höjdes vid 25 ° C och sedan skiftas till den experimentella temperatur under 5 dagar före mätningen. Som förväntat för denna ectothermic art, mängden CO2 som producerats ökade med temperaturen (Figur 2). Vi har tidigare visat att en sockerfri diet minskar ämnesomsättningen av både vildtyp och <e…

Discussion

I detta protokoll, beskriver vi en billig och tillförlitlig metod för mätning av CO ₂ produktion i flugor. Vi fann att detta experiment är enkelt, snabbt att genomföra och ger reproducerbara data som stämmer överens med andra studier ^{1, 6, 9.} Det protokoll som beskrivs här kan lätt modifieras för att passa alla laboratoriets budget och tillgängliga material. Konstruktionen av varje enskild respirometer kan anpassas så länge kammaren blir otät. Men ju längre, tunnare mikropipetter ger…

Materials

BlauBrand IntraMark 50µl micropipettes	VWR	612-1413
Soda Lime	Wako	CDN6847
Eosine	Sigma	031M4359	Any dye that can create visible colorization of liquid can be used
Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber	VWR	21432-761	Any transparent glass chamber that can be closed with the lid
Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit	Flinn	FB1438
Power Gel Glue	Pritt
1 ml pipett tips	Any
Foam	Any
Plaesticine Putty	Any
Scalpel	Any
Twezzers	Any