ऊतक हदबंदी और अंतर निस्पंदन द्वारा प्रत्यारोपण के लिए mitochondria की रैपिड अलगाव और शुद्धि
Summary
स्तनधारी ऊतक बायोप्सी से माइटोकॉन्ड्रिया का तेजी से अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन किया है. चूहा जिगर या कंकाल की मांसपेशी की तैयारी एक वाणिज्यिक ऊतक dissociator साथ homogenized गया और माइटोकांड्रिया नायलॉन जाल फिल्टर के माध्यम से अंतर निस्पंदन से अलग थे. वैकल्पिक तरीकों का उपयोग कर 100 मिनट – Mitochondrial अलगाव समय 60 की तुलना <30 मिनट है.
Abstract
अंतर centrifugation और / या Ficoll ढाल centrifugation का उपयोग पहले से वर्णित mitochondrial अलगाव तरीकों को पूरा करने के लिए 60-100 मिनट की आवश्यकता होती है. हम एक वाणिज्यिक ऊतक dissociator और अंतर निस्पंदन का उपयोग स्तनधारी बायोप्सी से माइटोकॉन्ड्रिया का तेजी से अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन. इस प्रोटोकॉल में, पुस्तिका homogenization ऊतक dissociator के मानकीकृत homogenization चक्र के साथ बदल रहा है. यह वर्दी और आसानी से मार्गदर्शन homogenization के साथ प्राप्त नहीं है कि ऊतक के अनुरूप homogenization के लिए अनुमति देता है. ऊतक हदबंदी के बाद, homogenate दोहराए centrifugation कदम को खत्म जो नायलॉन जाल फिल्टर, के माध्यम से फ़िल्टर्ड है. नतीजतन, mitochondrial अलगाव कम से कम 30 मिनट में किया जा सकता है. इस अलगाव प्रोटोकॉल 0.18 ± 0.04 छ (गीला वजन) ऊतक के नमूने से लगभग 2 एक्स 10 10 व्यवहार्य और श्वसन सक्षम माइटोकॉन्ड्रिया पैदावार.
Introduction
माइटोकॉन्ड्रिया लाल रक्त कोशिकाओं को छोड़कर शरीर में हर कोशिका में मौजूद हैं और महत्वपूर्ण सेलुलर और चयापचय की प्रक्रिया 1-4 की एक बड़ी संख्या में शामिल हैं. क्योंकि इनमें से कई कार्यों की, mitochondrial क्षति हानिकारक प्रभाव 3 हो सकता है. Mitochondrial समारोह और रोग कई mitochondrial अलगाव तरीकों की जांच करने के आदेश में वर्णित किया गया है. 1940 5-8 को mitochondrial अलगाव की तारीख की जल्द से जल्द प्रकाशित खातों. पहली दस्तावेज प्रयास कम गति 5,8 में नमक के घोल में centrifugation द्वारा पीछा एक मोर्टार में जिगर ऊतक पीस द्वारा mitochondrial अलगाव का प्रदर्शन किया. बाद में, अन्य समूहों के मूल प्रक्रिया पर विस्तार किया है और अंतर centrifugation 6-8 पर आधारित ऊतक विभाजन का प्रदर्शन किया. ये जल्दी तरीकों अक्सर homogenization, और / या अंतर centrifugation 9-15 शामिल है जो वर्तमान तकनीकों का आधार बनाया. homogenizati की संख्याकदम पर और centrifugation प्रोटोकॉल के बीच बदलता है. ये दोहराए चरणों mitochondrial अलगाव के लिए समय बढ़ाने के लिए और अंततः व्यवहार्यता को कम. ठीक से 10,16 नियंत्रित नहीं इसके अलावा, अगर पुस्तिका homogenization mitochondrial क्षति और असंगत परिणाम हो सकता है.
हाल ही में, हम दौरे ऊतक 17,18 में प्रत्यारोपण के लिए माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के homogenization और अंतर centrifugation इस्तेमाल किया. यह लंबा अलगाव की प्रक्रिया लगभग 90 मिनट की जरूरत है और इस विधि के नैदानिक प्रयोज्यता इसलिए सीमित था. नैदानिक और शल्य चिकित्सा उपचार में तीव्र चिकित्सकीय प्रयोग के लिए अनुमति देने के लिए हम कम से कम 30 मिनट में किया जा सकता है कि एक तेजी से mitochondrial अलगाव प्रक्रिया का विकास किया है.
इस प्रोटोकॉल का प्रमुख लाभ मानकीकृत ऊतक हदबंदी वर्दी और आसानी से मार्गदर्शन homogenization के साथ प्राप्त नहीं है कि ऊतक के अनुरूप homogenization के लिए अनुमति देता है कि कर रहे हैं. Addit मेंआयन, अंतर centrifugation की जगह में अंतर निस्पंदन का उपयोग समय लगता है और अत्यधिक, विशुद्ध रूप से व्यवहार्य और श्वसन सक्षम माइटोकॉन्ड्रिया का अधिक तेजी से अलगाव के लिए अनुमति दोहराए centrifugation कदम समाप्त.
कम से कम 30 मिनट में व्यवहार्य और श्वसन सक्षम माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने की क्षमता नैदानिक प्रयोज्यता के लिए अनुमति देता है. इस अलगाव प्रोटोकॉल कोरोनरी धमनी बाईपास ग्राफ्टिंग सर्जरी (सीएबीजी) और अन्य चिकित्सकीय प्रक्रियाओं में उपयोग के लिए क्षमता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इसे सफलतापूर्वक mitochondrial व्यवहार्यता को संरक्षित करने के लिए बर्फ पर सभी समाधान और ऊतकों के नमूनों को रखने के लिए आवश्यक है इस प्रोटोकॉल का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया अलग. बर्फ पर बनाए रखा, तब भी जब अलग माइटोक?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह अध्ययन राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान अनुदान HL- 103,542, और कैप को BCH संज्ञाहरण रिसर्च फाउंडेशन के गणमान्य इन्नोवेटर पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84100 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Substilsin A | Sigma Aldrich | P5380 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5379 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S6191 | |
| KCl | Fisher Scientific | P2173 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit |
Perkin Elmer | 6016941 | |
| Equipment | |||
| 50 mL Conical Tubes | BD | 352098 | |
| 40 μm Nylon Filters | BD | 352340 | |
| GentleMACS C tube | Miltenyl Biotech | 120-005-331 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 mm biopsy punch | Miltex | 33-36 | |
| 10 μm Pluristrainer | Pluriselect | 43-500-10-03 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415C | Marshall Scientific | EP-5415C | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotech | 130-093-235 | |
| 96-well plates, tissue culture treated | VWR | 82050-732 | |
| Rotomax 120 orbital shaker | Heidolph | 544-41200-00 | |
| Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader |
BioTek | ||
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | |
| Oxytherm System | Hansatech Instruments | ||
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
Referências
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