Rápido isolamento e purificação de mitocôndrias para o transplante pela dissociação do tecido e Filtração Diferencial

Resumo

Um método para o isolamento rápido de mitocôndrias a partir de biópsias de tecidos de mamíferos é descrito. Preparações de fígado de rato ou de músculo esquelético foram homogeneizados com um Dissociator tecido comercial e mitocôndrias foram isoladas por meio de filtração através de filtros de diferencial de malha de nylon. Tempo de isolamento mitocondrial é <30 min, em comparação com 60 - 100 min utilizando métodos alternativos.

Resumo

Métodos de isolamento mitocondriais descritas anteriormente, utilizando centrifugação diferencial e / ou centrifugação em gradiente de Ficoll exigir de 60 a 100 min para completar. Descreve-se um método para o isolamento rápido de mitocôndrias a partir de biópsias de mamífero, utilizando um tecido comercial Dissociator filtração e diferencial. Neste protocolo, homogeneização manual é substituído por ciclo de homogeneização padronizada do Dissociator tecido. Isto permite uma uniforme e consistente homogeneização de tecido que não é facilmente conseguido com a homogeneização manual. Após a dissociação de tecidos, o produto homogeneizado é filtrado através de filtros de nylon de malha, o que elimina os passos de centrifugação repetitivas. Como resultado, o isolamento mitocondrial pode ser realizada em menos de 30 min. Este protocolo de isolamento rende aproximadamente 2 x 10 ¹⁰ mitocôndrias competentes viáveis ​​e respiratória de 0,18 ± 0,04 g (peso húmido) de uma amostra de tecido.

Introdução

As mitocôndrias existem em todas as células do corpo, excepto as células vermelhas do sangue e são envolvidos num grande número de importantes processos celulares e metabólicas ^1-4. Devido a estas várias funções, dano mitocondrial pode ter efeitos prejudiciais ^3. A fim de investigar a função mitocondrial e disfunção de vários métodos de isolamento mitocondriais foram descritos. Os primeiros relatos publicados de data isolamento mitocondrial à década de 1940 ^5-8. A primeira tentativa documentada demonstrado isolamento mitocondrial por trituração do tecido do fígado, num almofariz, seguido por centrifugação de uma solução de sal de

Protocolo

Preparação

1. Prepare 1 M K-HEPES da Solução (ajustar o pH para 7,2 com KOH).
2. Prepare 0,5 M K-EGTA da Solução (ajustar o pH para 8,0 com KOH).
3. Prepare 1 M KH ₂ PO ₄ da solução.
4. Prepare 1 M _MgCl2 da solução.
5. Preparar tampão de homogeneização (pH 7,2) 300 mM de sacarose, 10 mM de K-HEPES, e 1 mM de K-EGTA. Armazenar a 4 ° C.
6. Preparar tampão de respiração de 250 mM de sacarose, 2 mM de KH ₂ PO _4, 10 mM de _MgCl2, 20 mM de K-HEPES (pH 7,2) e 0,5 mM de K-EGTA (pH 8,0). Armazenar a 4 ° C.
7. Prepare PBS 10x da solução por dissolução de 80 g de N....

Resultados

A figura delinear os passos processuais no isolamento de mitocôndrias utilizando dissociação do tecido e filtração diferencial está representada na Figura 1. Tempo processual total é inferior a 30 min.

As amostras de tecido foram obtidas utilizando um punch de 6 mm. O peso do tecido era de 0,18 ± 0,04 g (peso molhado). O número de mitocôndrias isoladas, como determinado por contagem de tamanho de partícula foi de 2,4 x 10 ¹⁰ ± 0,1 x 10 ¹⁰ mitocôndrias p.......

Discussão

Para isolar com sucesso mitocôndrias que utilizam este protocolo é fundamental para manter todas as soluções e amostras de tecido em gelo para preservar a viabilidade mitocondrial. Mesmo quando mantidos em gelo, as mitocôndrias isoladas irá exibir uma diminuição na actividade funcional ao longo do tempo ^19. Recomendamos que todas as soluções e adições ser pré-preparado. Nós pré-pesar e armazenar Subtilisina A em alíquotas de 4 mg em 1,5 ml de tubos de microcentrífuga e armazená-las a -20 ° C. Similarmente BSA.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sucarose	Sigma Aldrich	84100
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Substilsin A	Sigma Aldrich	P5380
BSA	Sigma Aldrich	A7906
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5379
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
NaCl	Sigma Aldrich	S6191
KCl	Fisher Scientific	P2173
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374
ATPlite >	Perkin Elmer
Tubos Cônicos de 50 ml	BD	352098
40 μ m Filtros de Nylon	BD	352340
Tubo C GentleMACS	Miltenyl Biotech	120-005-331
Tubo Eppendorf de 1,5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
Punção de biópsia de 6 mm	Miltex	33-36
10 μ m Pluristrainer	Pluriselect	43-500-10-03
Centrífuga Eppendorf 5415C	Marshall	Scientific EP-5415C
Dissociador GentleMACS	Miltenyl Biotech	130-093-235
, tratadas com cultura de tecidos	VWR	82050-732
Rotomax 120 agitador orbital	Heidolph	544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode   Leitor de Microplacas	BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter	Beckman Coulter	A63076
Sistema Oxytherm	Hansatech Instruments
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110

6016941Placas de 96 poços