Fundamental elementos técnicos de Freeze-fractura / Freeze-grabado en Biológica Microscopía Electrónica
Summary
Se describen las técnicas básicas y los refinamientos de procesamiento de congelación-fractura de las muestras y los nanomateriales biológicos para el examen por microscopía electrónica de transmisión. Esta técnica es un método preferido para revelar características ultraestructurales y especializaciones de las membranas biológicas y para la obtención de datos de dimensiones y espaciales a nivel ultraestructural en ciencias de los materiales y productos de la nanotecnología.
Abstract
Criofractura / congelación grabado describe un proceso por el cual las muestras, por lo general biológico o nanomaterial en la naturaleza, se congelan, fracturar y replicado para generar un carbono / platino "fundido" destinada a examen mediante microscopía electrónica de transmisión. Las muestras se someten a la tasa de congelación ultrarrápidos, a menudo en presencia de agentes crioprotectores para limitar la formación de cristales de hielo, con posterior fractura de la muestra en nitrógeno líquido enfría temperaturas bajo alto vacío. La superficie fracturada resultante se replica y se estabilizó por evaporación de carbono y platino desde un ángulo que confiere detalle superficie tridimensional para el reparto. Esta técnica ha demostrado ser particularmente instructivo para la investigación de las membranas celulares y sus especializaciones y ha contribuido considerablemente a la comprensión de la forma celular para la función celular relacionada. En este informe, examinamos los requisitos de instrumentos y protocolo técnico para la realización decongelación-fractura, la nomenclatura y las características de los planos de fractura asociado, las variaciones en el procedimiento convencional, y criterios para la interpretación de las imágenes de congelación de fractura. Esta técnica se ha utilizado ampliamente para la investigación ultraestructural en muchas áreas de la biología celular y mantiene la promesa como una técnica de imagen molecular emergente de la nanotecnología, y los estudios de la ciencia de materiales.
Introduction
El concepto y la aplicación práctica de procesamiento de congelación-fractura de las muestras biológicas se introdujo por Steere 1 más de la mitad de hace un siglo. El aparato temprana apropiado componentes dispares en una unidad autónoma de trabajo 1. El aparato original fue modificado y refinado en instrumentos disponibles comercialmente con el fin de acomodar la necesidad crítica para la manipulación a distancia, el mantenimiento de alto vacío, y la evaporación de carbono y metales para producir una réplica adecuado para el examen por microscopía electrónica de transmisión (Figura 1 y la Figura 2).
El instrumento típico consiste en una cámara de alto vacío con mesa de espécimen y el brazo microtomo tener rendimientos de nitrógeno líquido regulables (Figura 1). La cámara también cuenta con dos cañones de electrones, uno para la estabilización de la evaporación de carbono colocados en un ángulo de 90 º a la platina y el otro para platinum / carbono sombra en un ángulo ajustable, típicamente 15 º – 45 º (Figura 2). Alimentación a la unidad se aplica para accionar la bomba de vacío y paneles electrónicos regular ajuste de la temperatura y de electrones control de armas.
Originalmente concebido como un medio para lograr una mejor imagen de los virus, criofractura ganado aún más popularidad como una técnica para el examen y análisis de las membranas celulares y sus especializaciones 2, 3. De hecho, este procedimiento ha sido parte integral de la aclaración de las relaciones estructura / función en las células y tejidos, y muchos de estos estudios destacan como clásicos contribuciones a la biología celular y molecular 4-9. El principal objetivo y razón para el desarrollo de la técnica de congelación-fractura era limitar los artefactos observables en la resolución microscópica de electrones derivados de la fijación química y el procesamiento utilizado en microscopía electrónica biológico convencional. Aquí el objetivo es limitar químicala fijación y para congelar la muestra con suficiente velocidad y con frecuencia en presencia de un crioprotector a fin de limitar la formación de cristales de hielo y otros artefactos de congelación. Más recientemente, esta técnica ha encontrado un resurgimiento del interés por parte de los biólogos moleculares y los investigadores de ciencia de los materiales para el examen de las nanopartículas y nanomateriales.
Imágenes criofractura y el embargo preventivo de grabado exhiben un carácter tridimensional y, a veces se confunden con microscopio electrónico de barrido. Sin embargo, los preparativos de congelación de fractura son examinadas por microscopía electrónica de transmisión y de su importante contribución a los estudios morfológicos de alta resolución es su representación única de elementos de estructura / función de las membranas celulares. Procesamiento de congelación-fractura se inicia mediante la congelación de células y tejidos con una velocidad suficiente para limitar la cristalización del hielo y / o con el uso de agentes crioprotectores tales como glicerol. Las muestras son luego fracturaron al vacío y un representantelica se genera por evaporación de carbono y platino sobre la superficie fracturada. El ejemplar original se digiere de la réplica de la que se recupera en una rejilla de muestras estándar de EM. Otra mala interpretación común de las imágenes de congelación de fractura es que representan las superficies celulares. Sin embargo, la premisa básica de congelación-fractura es que las membranas biológicas se dividen a través de la bicapa lipídica por el proceso de fractura (Figura 3). Este proceso en las membranas biológicas produce dos caras de fractura, uno que revela la organización de la media de la membrana adyacente al citoplasma, el PF-cara, y uno que revela la media de la valva bimolecular de la membrana que está adyacente a la extracelular medio, el EF-cara. Superficies celulares verdaderos no están representados en imágenes de congelación-fractura, pero sólo aparecen cuando se utiliza la etapa posterior añadido de congelación-grabado siguiendo el procedimiento de la fractura. Para grabar con eficacia especímenes previamente fracturados para revelar deta superficiel, los especímenes deben congelarse a un ritmo rápido y sin unetchablecryoprotectant. Grabado de agua de la superficie de la muestra fracturadas que revelan características subyacentes se lleva a cabo colocando el brazo microtomo enfriamiento durante la etapa de muestra de la creación de un diferencial de temperatura entre la etapa de celebración de la muestra y el brazo microtomo de enfriamiento que hace que el agua para sublimar de la superficie. Cuando el agua se sublima desde la superficie de la muestra fracturados durante la maniobra de congelación-aguafuerte, a continuación, los aspectos de las superficies reales de células, matriz extracelular, las estructuras del citoesqueleto, y conjuntos moleculares pueden ser revelados a alta resolución. Así por congelación y congelar fractura de grabado no son términos intercambiables sino más bien refleja un proceso paso a paso el último de los cuales puede no ser necesario o deseable dependiendo de las necesidades del estudio particular.
A raíz de la congelación-fractura / congelar-grabado procedimientos, las superficies fracturadas se someten a evapora dirigidosTIVE capas de carbono y platino con el fin de proporcionar apoyo y formación de imágenes de contraste a la réplica. El platino imágenes evaporación / carbono puede ser unidireccional o rotatorio y se lleva a cabo por cualquiera de resistencia o cañones de electrones. Sombreado unidireccional desde un ángulo conocido, típicamente 30 º – 45 º, es útil en la realización de ciertos cálculos morfométricos. Las muestras que han sido sometidos a lo profundo de grabado normalmente son rotatorio sombra y las imágenes resultantes de estos especímenes son fotográficamente invierten para su evaluación.
El histórico, así como una meta actual de la / técnica de congelación de grabado de congelación-fractura es limitar la fijación química y procesamiento de muestras artefactos que están asociados con los procedimientos de microscopía electrónica de transmisión más convencional. Sin embargo, esta técnica proporciona una ventaja sustancial en su capacidad para conferir detalle en tres dimensiones y por lo tanto facilitar la adquisición de los datos morfométricos en biológica, ciencia de los materiales, y nespecímenes anotechnology. Procedimientos criofractura y el embargo preventivo de grabado son complejos y de múltiples facetas y algunos aspectos de su aplicación son personalizados. Esta presentación ofrece una visión encuesta de las principales características del proceso y se remite al lector a los protocolos completos publicados 10, 11 con el fin de abordar los detalles y personalizar el proceso para las necesidades específicas de investigación.
Protocol
Representative Results
Discussion
En los años siguientes a su introducción y disponibilidad comercial, congelación-fractura / procedimientos de grabado fueron ampliamente utilizados para investigaciones de la estructura de la membrana biológica. De hecho, las mejores perspectivas de algunas de las especializaciones estructurales de las membranas se han obtenido en las preparaciones de congelación-fractura / Etch. Estos estudios no sólo han contribuido a la comprensión de la organización estructural de las membranas, pero también proporcionaron …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This presentation was supported by a Clinical Innovator Award to JLC from the Flight Attendant Medical Research Institute and by the United States Environmental Protection Agency. Although the research described in this article has been funded wholly or in part by the United States Environmental Protection Agency through Cooperative Agreement CR83346301 with the Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology at The University of North Carolina at Chapel Hill, it has not been subjected to the Agency’s required peer and policy review, and therefore does not necessarily reflect the views of the Agency and no official endorsement should be inferred. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant | Balzers | BAF400T | |
| Standard buffers | various suppliers | ||
| standard aldehyde fixatives | various suppliers | ||
| sodium dichromate | various suppliers | ||
| sulfuric acid | various suppliers | ||
| Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation | Technotrade International | ||
| Liquid nitrogen | various suppliers | ||
| Freon | various suppliers | ||
| Disposable supplies for electron microscopy | Electron Microscopy Sciences | ||
| Transmission electron microscope | Carl Zeiss Inc. |
Referências
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