Grundlæggende tekniske elementer af Freeze-fraktur / Freeze-etch i Biologisk Electron Microscopy

Summary

Grundlæggende teknikker og finpudsninger af fryse-fraktur behandling af biologiske prøver og nanomaterialer til undersøgelse ved transmission elektronmikroskopi beskrives. Denne teknik er en foretrukken metode til at afsløre ultrastrukturelle funktioner og specialer i biologiske membraner, og for at opnå ultrastrukturel niveau dimensionelle og geodata i materialevidenskab og nanoteknologiske produkter.

Abstract

Fryse-fraktur / fryse-etch beskriver en proces, hvor prøver, typisk biologisk eller nanomateriale i naturen, er frosne, brækket, og gentages for at generere en carbon / platin "kastet" beregnet til undersøgelse ved transmission elektronmikroskopi. Prøver udsættes for ultrahurtige frysning satser, ofte i nærværelse af kryobeskyttelsesmidler at begrænse iskrystaldannelse med efterfølgende brud af prøven ved flydende kvælstof afkølede temperaturer under højt vakuum. Den resulterende brudfladen replikeres og stabiliseres ved fordampning af carbon og platin fra en vinkel, som giver overfladen tredimensionale detaljeret til afstøbningen. Denne teknik har vist sig særlig oplysende for undersøgelse af cellemembraner og deres specialer og har bidraget væsentligt til forståelsen af ​​cellulære form relateret celle funktion. I denne rapport undersøge vi de instrumentspecifikke krav og teknisk protokol for udførelse affryse-fraktur, den tilhørende nomenklatur og egenskaber for fraktur fly, variationer på den konventionelle procedure og kriterier for fortolkning af fryse-fraktur billeder. Denne teknik har været meget anvendt til ultrastrukturel undersøgelse i mange områder af cellebiologi og lover som en ny imaging teknik til molekylær, nanoteknologi og materialevidenskab studier.

Introduction

Konceptet og praktisk anvendelse af fryse-fraktur behandling af biologiske prøver blev introduceret af Steere ¹ over et halvt århundrede siden. Den tidlige apparat tilegnet forskellige komponenter i en arbejdsgruppe selvstændig enhed ^1. Den oprindelige apparat blev ændret og finpudset i kommercielt tilgængelige instrumenter for at imødekomme kritiske behov for ekstern manipulation, vedligeholdelse af højt vakuum og fordampning af kulstof og metal til at producere en kopi egnet til undersøgelse ved transmission elektron mikroskopi (figur 1 og figur 2).

Den typisk instrument består af et stort vakuumkammer med prøven bord og mikrotom arm har regulerbar flydende nitrogen gennemløb (figur 1). Kammeret huser også to elektronkanoner, en for at stabilisere kulstof fordampning placeret i en 90 ° vinkel til den model scenen og den anden for Platinum / carbon shadowing på en justerbar vinkel, typisk 15 º – 45 º (figur 2). Strøm til enheden anvendes til at betjene vakuumpumpen og elektroniske paneler regulere justering og elektron temperatur pistol kontrol.

Oprindeligt tænkt som et middel til at opnå en bedre billeddannelse af vira, fryse-fraktur vundet endnu mere popularitet som en teknik til undersøgelse og analyse af cellemembraner og deres specialer ^{2, 3.} Faktisk har denne fremgangsmåde været en integreret belyse struktur / funktions relationer i celler og væv, og mange af disse undersøgelser står som klassiske bidrag til cellebiologi og molekylær biologi ^4-9. Det vigtigste mål og rationale for udvikling af fryse-fraktur teknik var at begrænse artefakter observerbare ved elektronmikroskopisk resolution fra kemisk fiksering og behandling, der anvendes i konventionel biologisk elektronmikroskopi. Her er målet at de kemiskefiksering og indefryse modellen med tilstrækkelig hastighed og ofte i nærværelse af en kryoprotektant for at begrænse iskrystaldannelse og andre indefrysning artefakter. På det seneste har denne teknik fundet en genopblussen af ​​interesse fra molekylærbiologer og materialevidenskab efterforskere til undersøgelse af nanopartikler og nanomaterialer.

Fryse-fraktur og fryse-etch billeder udviser en tredimensionel karakter og til tider forveksles med scanningselektronmikrografer. Dog er fryse-fraktur præparater undersøgt ved transmissionselektronmikroskopi og deres store bidrag til morfologiske undersøgelser i høj opløsning er deres unikke repræsentation af struktur / funktions elementer af cellemembraner. Fryse-fraktur-behandling initieres ved frysning celler og væv med tilstrækkelig hastighed til at begrænse is krystallisation og / eller med anvendelse af kryobeskyttende midler, såsom glycerol. De prøver derefter splittet under vakuum, og en replica genereres ved fordampning af carbon og platin i brudfladen. Den oprindelige prøve fordøjes fra den replika, der er hentet på en standard EM eksemplar nettet. En anden almindelig fejlfortolkning af fryse-fraktur billeder er, at de skildrer celleoverfladerne. Men den grundlæggende forudsætning af fryse-fraktur er, at biologiske membraner er delt gennem lipiddobbeltlaget ved fraktur proces (figur 3). Denne proces i biologiske membraner giver to brudfladerne, en, der afslører tilrettelæggelsen af ​​halvdelen af ​​membranen tilgrænsende til cytoplasmaet, PF-ansigt, og en, der afslører halvdelen af ​​bimolekylære indlægsseddel af membranen, der er tilstødende til det ekstracellulære milieu, er EF-ansigt. Sande celleoverflader er ikke repræsenteret i fryse-fraktur-billeder, men kun, når det efterfølgende tilsættes trin af fryse-ætsning efter bruddet procedure anvendes. For effektivt at ætse tidligere brækkede prøver at afsløre overflade detail, må prøver nedfryses i et hastigt tempo og uden unetchablecryoprotectant. Ætsning af vand fra overfladen af ​​de frakturerede prøve afslører underliggende funktioner opnås ved at placere afkøling mikrotom armen over prøven fase skabe en temperaturforskel mellem scenen holder prøven og afkøling mikrotom arm, som bevirker, at vand sublimere fra overfladen. Når vand sublimeres fra overfladen af ​​de frakturerede prøve under fryse-ætsning manøvre, så aspekter af faktiske celleoverflader, ekstracellulær matrix, cytoskeletale strukturer og molekylære enheder kan blive afsløret ved høj opløsning. Således fryse-fraktur og fryse-etch er ikke udskiftelige udtryk, men snarere afspejler en trinvis proces hvor sidstnævnte måske ikke nødvendig eller ønskelig, afhængigt af behovene i den pågældende undersøgelse.

Efter fryse-fraktur / fryse-etch procedurer er de brudflader underkastet styret fordamperentiv frakker af kulstof og platin med henblik på at yde støtte og billedbehandling kontrast til replika. Den platin / carbon imaging fordampning kan være ensrettede eller roterende og opnås ved enten modstand eller elektronkanoner. Envejs skygning fra en kendt vinkel, typisk 30 ° – 45 °, er nyttig ved udførelse af visse morfometriske beregninger. Prøver, der er blevet udsat for dyb-ætsning typisk roterende skygget og de resulterende billeder af disse prøver er fotografisk tilbageføres til evaluering.

Den historiske såvel som en nuværende mål for fryse-fraktur / fryse-etch teknik er at begrænse kemisk fiksering og behandling prøven artefakter, der er forbundet med flere konventionelle transmissionselektronmikroskopi procedurer. Men denne teknik giver en væsentlig fordel i dens evne til at give tre-dimensionelle detalje og dermed lette køb af morfometriske data i biologiske, materiallære, og nanotechnology prøver. Fryse-fraktur og fryse-etch procedurer er komplekse og mangesidede, og nogle aspekter af dets anvendelse er tilpasset. Denne præsentation byder på en undersøgelse betragtning af de vigtigste funktioner i processen, og læseren henvises til omfattende publicerede protokoller ^{10, 11} for at løse detaljerne og tilpasse processen for specifikke forskningsbehov.

Protocol

1. Fremstilling af biologiske prøver til Freeze-fraktur / Freeze-etch Brug en konventionel EM fiksativ formulering, såsom 2% glutaraldehyd + 2% paraformaldehyd i 0,1 M phosphatpuffer i 1 time. at udføre primære fiksering af biologiske væv. BEMÆRK: Selv om det kan være ønskeligt at fastfryse nogle typer af prøver uden forudgående fiksering, universelle blodbårne patogen forholdsregler mandat passende fiksering hvor prøven består af humant væv. Efter den primære fiksering skylles modell…

Representative Results

Nøglen forudsætning af fryse-fraktur tolkning er, at fraktur fly passere gennem lipiddobbeltlaget af membraner, der giver to brudfladerne, kaldet konventionelt PF-flade (plasma-fraktur-ansigt) og EF-flade (ekstracellulær fraktur-ansigt) (figur 3). PF-ansigt er halvdelen af ​​membranlipiddobbeltlaget støder op til cellens cytoplasma og EF-ansigt er halvdelen af ​​membranlipiddobbeltlaget støder op til det ekstracellulære miljø. Den fryse-fraktur teknik er særlig nyttig til undersøgelse a…

Discussion

I årene efter dens indførelse og kommercielle tilgængelighed, fryse-fraktur / etch procedurer blev i vid udstrækning brugt til undersøgelser af den biologiske membran struktur. Faktisk har de bedste perspektiver for nogle af de strukturelle specialiseringer af membraner blevet opnået i fryse-fraktur / etch præparater. Disse undersøgelser ikke blot har bidraget til forståelsen af ​​den strukturelle organisering af membraner, men også indsigt i, hvordan struktur og funktion hænger sammen.

<p class="jove…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant	Balzers	BAF400T
Standard buffers	various suppliers
standard aldehyde fixatives	various suppliers
sodium dichromate	various suppliers
sulfuric acid	various suppliers
Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation	Technotrade International
Liquid nitrogen	various suppliers
Freon	various suppliers
Disposable supplies for electron microscopy	Electron Microscopy Sciences
Transmission electron microscope	Carl Zeiss Inc.