Fundamentele Technische Elementen van Freeze-fractuur / Freeze-ets in Biological Electron Microscopy
Summary
Basistechnieken en verfijningen van freeze-fractuur verwerking van biologische monsters en nanomaterialen voor onderzoek door transmissie elektronenmicroscopie worden beschreven. Deze techniek is een aangewezen methode voor het onthullen ultrastructureel functies en specialisaties van biologische membranen en voor het verkrijgen van Ultrastructureel dimensionale en ruimtelijke gegevens in materials sciences en nanotechnologie producten.
Abstract
Freeze-fractuur / vries-ets beschrijft een proces waarbij exemplaren, meestal biologisch of nanomateriaal in de natuur, zijn bevroren, gebroken, en gerepliceerd naar een carbon / platinum "cast" bestemd voor onderzoek door transmissie elektronenmicroscopie genereren. Specimens worden onderworpen aan ultrasnelle vriessnelheden, vaak in aanwezigheid van cryoprotectieve middelen voor ijskristalvorming beperken latere breken van het model in vloeibare stikstof gekoelde temperaturen onder hoog vacuüm. De resulterende gebroken oppervlak wordt gerepliceerd en gestabiliseerd door verdamping van koolstof en platina vanuit een hoek die oppervlak verleent driedimensionale detail aan de cast. Deze techniek is bijzonder verhelderend voor het onderzoek van de celmembranen en hun specialisaties bewezen en heeft aanzienlijk bijgedragen aan het begrip van cellulaire vorm aan verwante celfunctie. In dit rapport geven we een overzicht van de eisen instrument en technisch protocol voor het uitvoeren vanbevriezen-breuk, de bijbehorende nomenclatuur en de kenmerken van breukvlakken, variaties op de klassieke procedure en criteria voor de interpretatie van de freeze-fractuur beelden. Deze techniek is op grote schaal gebruikt voor ultrastructurele onderzoek in veel gebieden van de celbiologie en houdt belofte als een opkomende beeldvormende techniek voor moleculaire, nanotechnologie en materiaalkunde studies.
Introduction
Het concept en de praktische toepassing van freeze-fractuur verwerking van biologische monsters werd een eeuw geleden geïntroduceerd door Steere 1 meer dan de helft. De vroege apparaat toegeëigend ongelijksoortige onderdelen in een werkende zelfstandige unit 1. De oorspronkelijke inrichting werd aangepast en verfijnd tot commercieel beschikbare instrumenten om de kritische behoefte aan externe manipulatie, het onderhoud van hoog vacuüm tegemoet te komen, en de verdamping van koolstof en metalen om een replica geschikt is voor onderzoek door transmissie elektronenmicroscopie (Figuur 1 pt Figuur produceren 2).
De typische instrument bestaat uit een hoog vacuümkamer specimens tafel en microtoom arm met regelbare vloeibare stikstof omzet (figuur 1). De kamer beschikt ook over twee elektron geweren, een voor het stabiliseren van koolstof verdamping gepositioneerd op een hoek van 90 graden met het model podium en de andere voor Platinum / carbon schaduw onder een instelbare hoek, meestal 15 ° – 45 ° (figuur 2). Stroom naar het apparaat wordt toegepast op de vacuümpomp werken en elektronische panelen reguleren temperatuurregeling en electron gun control.
Oorspronkelijk opgevat als middel om verbeterde beeldvorming van virussen bereiken, vries-breuk kreeg nog meer populariteit als een techniek voor het onderzoek en analyse van celmembranen en hun specialisaties 2, 3. Inderdaad, deze procedure integraal ophelderen structuur / functie relaties in cellen en weefsels en veel van deze studies passief klassieke bijdragen aan cellulaire en moleculaire biologie 4-9 geweest. Het hoofddoel en redenen voor de ontwikkeling van de freeze-fractuur technisch artefacten waarneembaar elektronenmicroscopische resolutie voortvloeien uit chemische fixatie en verwerking in gebruikelijke biologische elektronenmicroscopie beperken. Hier is het doel om chemische beperkenfixatie en het monster voldoende snel en vaak in de aanwezigheid van een koude beschermend om ijskristalvorming en andere artefacten invriezen beperken bevriezen. Meer recent heeft deze techniek een heropleving van interesse van moleculair biologen en materiaalkunde onderzoekers voor onderzoek van nanodeeltjes en nanomaterialen gevonden.
Freeze-breuk en vries-etch beelden vertonen een driedimensionaal karakter en soms verward scanning electronenmicroscoop. Echter, freeze-fractuur voorbereidingen onderzocht door transmissie elektronenmicroscopie en hun belangrijke bijdrage aan de hoge resolutie morfologische studies is hun unieke voorstelling van structuur / functie-elementen van de celmembranen. Freeze-breuk verwerking geïnitieerd bevroren cellen en weefsels met voldoende snelheid ijskristallisatie beperken en / of bij gebruik van cryoprotectant middelen zoals glycerol. De monsters worden vervolgens gebroken onder vacuüm en een repLica wordt gegenereerd door verdamping van koolstof en platina via breukvlak. Het originele exemplaar wordt verteerd van de replica die wordt opgehaald op een standaard EM specimen net. Een andere veel voorkomende verkeerde interpretatie van freeze-fractuur beelden is dat ze uitbeelden celoppervlak. Maar het uitgangspunt van freeze-fractuur is dat biologische membranen worden gesplitst door de lipide dubbellaag van de fractuur-proces (figuur 3). Dit proces in biologische membranen levert twee breuk vlakken, een die de organisatie van de helft van het membraan grenzend aan het cytoplasma, de PF-face openbaart, en een die helft van de bimoleculaire bijsluiter van het membraan dat grenst aan het extracellulaire openbaart milieu, de EF-face. True cel oppervlakken zijn niet vertegenwoordigd in freeze-fractuur beelden, maar alleen wanneer de volgende toegevoegde stap van freeze-etsen na de breuk procedure wordt gebruikt. Om effectief te etsen eerder gebroken exemplaren aan de oppervlakte detai onthullenl, moeten de monsters bij een snel tempo en zonder unetchablecryoprotectant worden bevroren. Ets water van het oppervlak van het proefstuk gebroken openbaren onderliggende factoren wordt bewerkstelligd door het zo koelen microtoom arm via specimen stadium creëren van een temperatuurverschil tussen de fase die het specimen en het koelen microtoom arm die water veroorzaakt sublimeren van het oppervlak. Wanneer water wordt gesublimeerd van het oppervlak van het proefstuk gebroken tijdens het bevriezen etsen manoeuvre, dan aspecten daadwerkelijk celoppervlakken, extracellulaire matrix, cytoskeletstructuren en moleculaire assemblages kunnen worden onthuld met hoge resolutie. Aldus bevriezen-breuk en vries-etch zijn niet uitwisselbaar termen maar tijdens een stapsgewijze werkwijze waarbij de laatste niet nodig of wenselijk zijn afhankelijk van de behoeften van de specifieke studie.
Naar aanleiding van de vries-fractuur / vries-ets procedures, het gebroken oppervlakken zijn onderworpen aan gerichte verdampertief lagen van koolstof en platina met het oog op ondersteuning en beeldvorming contrast met de replica te bieden. De platina / koolstof imaging verdamping kan unidirectioneel of roterende en wordt bewerkstelligd door een weerstand of elektronenkanonnen. Unidirectionele shadowing uit een bekende hoek, meestal 30 ° – 45 °, is handig in het uitvoeren van bepaalde morfometrische berekeningen. Monsters die zijn onderworpen aan diepe etsen typisch roterende schaduw en de resulterende afbeeldingen van deze monsters zijn fotografisch teruggedraaid evalueren.
De historische en een doelstelling van de onderhavige freeze-fractuur / vries-etch techniek chemische fixatie en verwerking beperken specimen artefacten die worden geassocieerd met conventionele transmissie elektronenmicroscopie procedures. Deze techniek levert een wezenlijke voordeel in zijn vermogen om driedimensionale detail kennen en dus de verkrijging van morfometrische data in biologisch, materiaalkunde vergemakkelijken en nanotechnology specimens. Freeze-fractuur en vries-ets procedures zijn complex en veelzijdig en sommige aspecten van de toepassing worden aangepast. Deze presentatie biedt een overzicht aanzicht van de belangrijkste kenmerken van de werkwijze en de lezer om de gegevens adres en pas de werkwijze specifieke onderzoekbehoeften uitgebreide gepubliceerde protocollen 10, 11 bedoeld.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de jaren na de invoering ervan en de commerciële beschikbaarheid, freeze-fractuur / etch procedures werden op grote schaal gebruikt voor het onderzoeken van de biologische membraan structuur. Inderdaad, de beste perspectieven van een aantal van de structurele specialisaties van membranen is verkregen in freeze-fractuur / etch voorbereidingen. Deze studies niet alleen bijdragen tot begrip van de structurele organisatie van de membranen maar ook ontvangen inzichten in structuur en functie zijn verbonden.
<p class=…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This presentation was supported by a Clinical Innovator Award to JLC from the Flight Attendant Medical Research Institute and by the United States Environmental Protection Agency. Although the research described in this article has been funded wholly or in part by the United States Environmental Protection Agency through Cooperative Agreement CR83346301 with the Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology at The University of North Carolina at Chapel Hill, it has not been subjected to the Agency’s required peer and policy review, and therefore does not necessarily reflect the views of the Agency and no official endorsement should be inferred. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant | Balzers | BAF400T | |
| Standard buffers | various suppliers | ||
| standard aldehyde fixatives | various suppliers | ||
| sodium dichromate | various suppliers | ||
| sulfuric acid | various suppliers | ||
| Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation | Technotrade International | ||
| Liquid nitrogen | various suppliers | ||
| Freon | various suppliers | ||
| Disposable supplies for electron microscopy | Electron Microscopy Sciences | ||
| Transmission electron microscope | Carl Zeiss Inc. |
Referências
- Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).
- Pinto da Silva, P., Branton, D. Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker. J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).
- Friend, D. S., Gilula, N. B. Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues. J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).
- Branton, D. Fracture faces of frozen membranes. ProcNatlAcadSci USA. 55, 1048-1056 (1966).
- Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release. J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella. J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of the outer dynein arm. J Cell Biol. 95, 798-815 (1982).
- Hirokawa, N., Heuser, J. E. Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells. J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).
- Hirokawa, N. Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton. Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).
- Chandler, D. E., Sharp, W. P., Kuo, J. o. h. n. Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1117, 95-132 (2014).
- Severs, N. J. Freeze-fracture electron microscopy. Nature Protocols. 2, 547-576 (2007).
- Gilula, N. B., Satir, P. The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization. J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).
- Rohatgi, R., Snell, W. J. The ciliary membrane. CurrOpin Cell Biol. 22, 541-546 (2010).
- Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future. Biol Cell. 103, 249-270 (2011).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium. Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture. J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets. Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).
- Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability. Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro. J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study. Am J Anat. 173, 257-268 (1985).
- Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells. J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).
- Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
- Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions. Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).
- Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium. Am J Respir Cell & Molec Biol. 1, 385-390 (1989).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection. Science. 206, 349-351 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease. Infect & Immun. 29, 1117-1124 (1980).
- Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung. J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure. Environ Res. 42, 155-165 (1987).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis. Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).
- Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke. InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).
- Boonstra, J., et al. Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture. J Microscopy. 140, 119-129 (1985).
- Fujimoto, K. Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes. J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).
- Quinn, P. J. The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes. J Control Release. 160, 158-163 (2012).
