Fondamentale elementi tecnici di Freeze-frattura / Fermo-etch in Biological microscopia elettronica
Summary
Sono descritte le tecniche di base e parametri di lavorazione congelamento-frattura di campioni biologici e dei nanomateriali per l'esame di microscopia elettronica a trasmissione. Questa tecnica è un metodo preferito per rivelare caratteristiche ultrastrutturali e specializzazioni delle membrane biologiche e per l'ottenimento di dati dimensionali e spaziali di livello ultrastrutturale in scienze dei materiali e dei prodotti nanotecnologici.
Abstract
Freeze-frattura / freeze-etch descrive un processo in cui i campioni, in genere biologici o nanomateriali in natura, sono congelati, fratturato, e replicato per generare un carbonio / platino "cast" destinato ad esame mediante microscopia elettronica a trasmissione. I campioni vengono sottoposti a tassi di congelamento ultrarapido, spesso in presenza di agenti crioprotettivi di limitare la formazione di cristalli di ghiaccio, con conseguente frattura del campione in azoto liquido raffreddato a temperature sotto alto vuoto. La superficie fratturata risultante viene replicato e stabilizzato mediante evaporazione di carbonio e platino da un angolo che conferisce dettaglio superficie tridimensionale al cast. Questa tecnica si è rivelata particolarmente illuminante per lo studio delle membrane cellulari e delle loro specializzazioni ed ha contribuito notevolmente alla comprensione della forma cellulare per la funzione delle cellule correlate. In questo rapporto, passiamo in rassegna i requisiti dello strumento e protocollo tecnico per l'esecuzione dicongelamento-frattura, la nomenclatura e le caratteristiche dei piani di frattura associata, variazioni sul procedimento tradizionale, e criteri per l'interpretazione delle immagini freeze-frattura. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata per le indagini ultrastrutturali in molti settori della biologia cellulare e detiene promessa come una tecnica di imaging emergente per molecolare, le nanotecnologie, e studi di scienza dei materiali.
Introduction
Il concetto e l'applicazione pratica del trattamento di congelamento-frattura di campioni biologici è stato introdotto da Steere 1 più di mezzo secolo fa. L'apparato presto stanziati componenti disparati in un self-contained unità di lavoro 1. Apparecchiatura originale è stato modificato e raffinato in strumenti disponibili in commercio per ospitare la necessità critica per la manipolazione a distanza, manutenzione di alto vuoto, e l'evaporazione di carbonio e metalli per produrre una replica adatto per l'esame al microscopio elettronico a trasmissione (Figura 1 e Figura 2).
Lo strumento tipico è composto da una camera a vuoto elevato con tavolo campione e braccio microtomo avente regolabili throughput azoto liquido (Figura 1). La camera ospita anche due cannoni elettronici, uno per stabilizzare evaporazione carbonio posizionato ad un angolo di 90 ° rispetto alla fase del campione e l'altro per Platinum / carbonio shadowing ad angolo regolabile, tipicamente 15 ° – 45 ° (Figura 2). Alimentazione dell'unità viene applicato per azionare la pompa del vuoto e pannelli elettronici a regolare la regolazione della temperatura e di elettroni controllo delle armi.
Originariamente concepito come un mezzo per conseguire una migliore imaging virus, congelamento-frattura guadagnato sempre più popolarità come una tecnica per l'esame e l'analisi delle membrane cellulari e delle loro specializzazioni 2, 3. Infatti, questa procedura è stata parte integrante chiarire le relazioni struttura / funzione di cellule e tessuti e molti di questi studi si distinguono come i contributi classici di biologia cellulare e molecolare 4-9. L'obiettivo principale e razionale per lo sviluppo della tecnica di congelamento-frattura era di limitare gli artefatti osservabili al microscopio elettronico a risoluzione derivante dalla fissazione chimica e lavorazione utilizzati in microscopia elettronica convenzionale biologica. Qui l'obiettivo è quello di limitare chimicafissazione e di congelare il campione con velocità sufficiente e spesso in presenza di un crioprotettore per limitare la formazione di cristalli di ghiaccio e altri artefatti congelamento. Più di recente, questa tecnica ha trovato una rinascita di interesse da biologi molecolari e gli investigatori scienza dei materiali per l'esame di nanoparticelle e nanomateriali.
Immagini Freeze-frattura e congelare-etch presentano un carattere tridimensionale e, a volte sono scambiati per microscopio elettronico a scansione. Tuttavia, i preparativi freeze-fratture sono esaminati mediante microscopia elettronica a trasmissione e il loro importante contributo agli studi morfologici ad alta risoluzione è la loro rappresentazione unica di elementi struttura / funzione delle membrane cellulari. Trasformazione Freeze-frattura è disposta dal congelamento cellule e tessuti con velocità sufficiente a limitare la cristallizzazione del ghiaccio e / o con l'uso di agenti crioprotettori come il glicerolo. I campioni vengono poi fratturate sotto vuoto e un rappresentantelica è generato per evaporazione di carbonio e platino sulla superficie fratturata. Il campione originale viene digerito dalla replica che viene recuperato su una griglia esemplare di serie EM. Un altro errore di interpretazione comune delle immagini freeze-frattura è che essi rappresentano superfici cellulari. Tuttavia la premessa di base di congelamento-frattura è che le membrane biologiche sono divise attraverso il doppio strato lipidico dal processo di frattura (Figura 3). Questo processo in membrane biologiche produce due facce di frattura, uno che rivela l'organizzazione della metà della membrana adiacente al citoplasma, il PF-faccia, e uno che rivela la metà del foglio bimolecolare della membrana che è adiacente alla extracellulare milieu, l'EF-faccia. Superficie delle cellule veri non sono rappresentati nelle immagini freeze-frattura, ma appaiono solo quando si utilizza la successiva fase di aggiunta di freeze-etching seguendo la procedura di frattura. Al fine di incidere efficacemente campioni preventivamente fratturate per rivelare detai di superficiel, i campioni devono essere congelati a un ritmo rapido e senza unetchablecryoprotectant. Incisione di acqua dalla superficie del campione fratturati rivelano caratteristiche sottostanti si ottiene posizionando il braccio microtomo raffreddamento sul tavolino portaoggetti creando un differenziale di temperatura tra la fase che tiene il campione e il braccio microtomo raffreddamento che provoca l'acqua a sublimare dalla superficie. Quando l'acqua viene sublimata dalla superficie del campione fratturati durante la manovra di congelazione incisione, poi aspetti di superfici reali cellulari, matrice extracellulare, strutture del citoscheletro e assiemi molecolari possono essere rivelate ad alta risoluzione. Così freeze-frattura e congelare-etch non sono termini intercambiabili, ma piuttosto riflettono un processo graduale l'ultima delle quali può non essere necessario o desiderabile a seconda delle esigenze del particolare studio.
Dopo il congelamento-frattura / freeze-etch procedure, le superfici fratturate sono sottoposti a evaporazione direttitiva mani di carbonio e di platino, al fine di fornire sostegno e di imaging contrasto alla replica. Il / carbonio di imaging evaporazione platino può essere unidirezionale o rotativo, ed è compiuta da una resistenza o cannoni elettronici. Shadowing unidirezionale da un angolo noto, tipicamente 30 ° – 45 °, è utile per eseguire alcuni calcoli morfometrici. I campioni che sono stati sottoposti a profonda incisione in genere sono a rotazione in ombra e le immagini risultanti di questi esemplari sono fotograficamente invertiti per la valutazione.
Lo storico così come un attuale obiettivo del / tecnica di congelamento-frattura freeze-etch è quello di limitare la fissazione e la trasformazione chimica dei campioni artefatti che sono associati con più procedure di microscopia elettronica a trasmissione convenzionale. Tuttavia, questa tecnica fornisce un vantaggio sostanziale nella sua capacità di conferire dettaglio tridimensionale e quindi facilitare l'acquisizione dei dati morfometrici in biologico, scienza dei materiali, e nesemplari anotechnology. Procedure di congelamento-frattura e congelare-etch sono complessi e multi-sfaccettato e alcuni aspetti della sua applicazione sono personalizzati. Questa presentazione offre una vista panoramica delle principali caratteristiche del processo e si rimanda il lettore alla completa protocolli pubblicati 10, 11 al fine di affrontare i dettagli e personalizzare il processo per le esigenze di ricerca specifiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Negli anni successivi alla sua introduzione e la disponibilità commerciale, congelamento-frattura / procedure etch sono stati ampiamente utilizzati per le indagini di struttura della membrana biologica. Infatti, le migliori prospettive di alcune delle specializzazioni strutturali delle membrane sono state ottenute in preparati congelamento-frattura / etch. Questi studi non solo hanno contribuito alla comprensione della organizzazione strutturale delle membrane, ma anche fornito intuizioni su come la struttura e la funz…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This presentation was supported by a Clinical Innovator Award to JLC from the Flight Attendant Medical Research Institute and by the United States Environmental Protection Agency. Although the research described in this article has been funded wholly or in part by the United States Environmental Protection Agency through Cooperative Agreement CR83346301 with the Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology at The University of North Carolina at Chapel Hill, it has not been subjected to the Agency’s required peer and policy review, and therefore does not necessarily reflect the views of the Agency and no official endorsement should be inferred. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant | Balzers | BAF400T | |
| Standard buffers | various suppliers | ||
| standard aldehyde fixatives | various suppliers | ||
| sodium dichromate | various suppliers | ||
| sulfuric acid | various suppliers | ||
| Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation | Technotrade International | ||
| Liquid nitrogen | various suppliers | ||
| Freon | various suppliers | ||
| Disposable supplies for electron microscopy | Electron Microscopy Sciences | ||
| Transmission electron microscope | Carl Zeiss Inc. |
Referências
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