Fundamental Elements Técnica de Freeze-fratura / Freeze-etch em Biológica de Microscopia Eletrônica

Summary

São descritas as técnicas básicas e refinamentos de processamento de congelamento e fratura de amostras biológicas e nanomateriais para exame por microscopia eletrônica de transmissão. Esta técnica é um método preferido para revelar características ultra-estruturais e especializações de membranas biológicas e para a obtenção de dados dimensionais e espaciais de nível ultra-estrutural em ciências dos materiais e produtos da nanotecnologia.

Abstract

Freeze-fratura / congelar-etch descreve um processo pelo qual as amostras, normalmente biológica ou nanomaterial na natureza, são congelados, fraturado, e replicado para gerar um carbono / platina "cast" destina-se a exame de microscopia eletrônica de transmissão. As amostras são sujeitas a taxas de congelamento ultra-rápidos, muitas vezes na presença de agentes crioprotectores para limitar a formação de cristais de gelo, com subsequente fractura da amostra em azoto líquido temperaturas arrefeceu-se sob alto vácuo. A superfície de fractura resultante é replicado e estabilizado por meio de evaporação de carbono e platina a partir de um ângulo que confere a superfície pormenor tridimensional para o fundido. Esta técnica tem se mostrado particularmente esclarecedor para a investigação das membranas celulares e suas especializações e contribuiu consideravelmente para a compreensão da forma celular para a função das células relacionadas. Neste relatório, examinamos as exigências do instrumento e protocolo técnico para a realização decongelar-fratura, a nomenclatura e as características dos planos de fratura associada, variações sobre o procedimento convencional e os critérios de interpretação de imagens de congelamento e fratura. Esta técnica tem sido amplamente utilizada para a investigação ultra-estrutural em muitas áreas da biologia celular e promete ser uma técnica de imagem molecular para emergentes, nanotecnologia, e os estudos de ciência dos materiais.

Introduction

O conceito e aplicação prática do processamento de congelamento e fratura de amostras biológicas foi introduzido por ^uma Steere mais de meio século atrás. O aparelho cedo apropriou componentes díspares em uma unidade auto-suficiente trabalhar ^um. O aparelho inicial foi modificado e refinado em instrumentos comercialmente disponíveis, a fim de acomodar a necessidade crítica para a manipulação remota, manutenção de alto vácuo, e a evaporação do carbono e metais para produzir uma réplica apropriada para exame por microscopia electrónica de transmissão (Figura 1 e Figura 2).

O aparelho t....

Protocol

1 Preparação de amostras biológicas para Freeze-fratura / Freeze-etch

1. Use uma formulação fixador EM convencional, tal como o glutaraldeído a 2% + 2% de paraformaldeído em tampão fosfato 0,1 M durante 1 hora. para realizar a fixação primária de tecidos biológicos. Nota: Embora possa ser desejável para congelar alguns tipos de amostras sem fixação prévia, de agentes patogénicos transmissíveis pelo sangue precauções universais obrigar a fixação adequada em que a amostra consiste de tecido humano.
2. A seguir à fixação primária, enxaguar a amostra no mesmo tampão suplementado com sacarose a 0,2 M para não mais do que 1 hora.
3. Transfira a amostr....

Results

A premissa fundamental de interpretação da imagem criofratura é que planos de fratura atravessar a bicamada lipídica das membranas que conferem duas faces da fratura, chamado por convenção a PF-face (plasma fratura-face) e EF-face (extracelular fratura-face) (Figura 3). O PF-face é a metade da bicamada lipídica da membrana adjacente ao citoplasma da célula e o EF-face é a metade da bicamada lipídica da membrana adjacente ao meio extracelular. A técnica de congelação-fractura é particularmente útil para .......

Discussion

Nos anos seguintes a sua introdução e disponibilidade comercial, congelar-fratura / procedimentos de corrosão foram amplamente utilizado em investigações da estrutura da membrana biológica. Na verdade, as melhores perspectivas de algumas das especializações estruturais das membranas foram obtidos em preparações criofratura / etch. Estes estudos não só contribuiu para a compreensão da organização estrutural das membranas mas também forneceu insights sobre como a estrutura ea função estão relacionados.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balzers Planta de congelamento/congelamento	Balzers	BAF400T
Tampões padrão	vários fornecedores
Fixadores de aldeído padrão	vários fornecedores
Dicromato de sódio	vários fornecedores
Ácido sulfúrico	vários fornecedores
Suprimentos descartáveis para Evaporação de Platina/Carbono	Technotrade International
Nitrogênio líquido	vários fornecedores
Propano	vários fornecedores
Suprimentos descartáveis para microscopia eletrônica	Microscopia Eletrônica Ciências
Microscópio eletrônico de transmissão	Carl Zeiss Inc.