Fundamental Elements Técnica de Freeze-fratura / Freeze-etch em Biológica de Microscopia Eletrônica

Summary

São descritas as técnicas básicas e refinamentos de processamento de congelamento e fratura de amostras biológicas e nanomateriais para exame por microscopia eletrônica de transmissão. Esta técnica é um método preferido para revelar características ultra-estruturais e especializações de membranas biológicas e para a obtenção de dados dimensionais e espaciais de nível ultra-estrutural em ciências dos materiais e produtos da nanotecnologia.

Abstract

Freeze-fratura / congelar-etch descreve um processo pelo qual as amostras, normalmente biológica ou nanomaterial na natureza, são congelados, fraturado, e replicado para gerar um carbono / platina "cast" destina-se a exame de microscopia eletrônica de transmissão. As amostras são sujeitas a taxas de congelamento ultra-rápidos, muitas vezes na presença de agentes crioprotectores para limitar a formação de cristais de gelo, com subsequente fractura da amostra em azoto líquido temperaturas arrefeceu-se sob alto vácuo. A superfície de fractura resultante é replicado e estabilizado por meio de evaporação de carbono e platina a partir de um ângulo que confere a superfície pormenor tridimensional para o fundido. Esta técnica tem se mostrado particularmente esclarecedor para a investigação das membranas celulares e suas especializações e contribuiu consideravelmente para a compreensão da forma celular para a função das células relacionadas. Neste relatório, examinamos as exigências do instrumento e protocolo técnico para a realização decongelar-fratura, a nomenclatura e as características dos planos de fratura associada, variações sobre o procedimento convencional e os critérios de interpretação de imagens de congelamento e fratura. Esta técnica tem sido amplamente utilizada para a investigação ultra-estrutural em muitas áreas da biologia celular e promete ser uma técnica de imagem molecular para emergentes, nanotecnologia, e os estudos de ciência dos materiais.

Introduction

O conceito e aplicação prática do processamento de congelamento e fratura de amostras biológicas foi introduzido por ^uma Steere mais de meio século atrás. O aparelho cedo apropriou componentes díspares em uma unidade auto-suficiente trabalhar ^um. O aparelho inicial foi modificado e refinado em instrumentos comercialmente disponíveis, a fim de acomodar a necessidade crítica para a manipulação remota, manutenção de alto vácuo, e a evaporação do carbono e metais para produzir uma réplica apropriada para exame por microscopia electrónica de transmissão (Figura 1 e Figura 2).

O aparelho típico é constituído por uma câmara de alto vácuo e com o quadro de amostra braço micrótomo com débitos reguláveis ​​de azoto líquido (Figura 1). A câmara também abriga dois canhões de electrões, um estabilizante para a evaporação de carbono posicionados em um ângulo de 90 ° para a fase da amostra e o outro por platinum / carbono sombreamento num ângulo ajustável, tipicamente 15 ° – 45 ° (Figura 2). A alimentação da unidade é aplicada para operar a bomba de vácuo e painéis eletrônicos regular de ajuste de temperatura e eletrônica de controle de armas.

Originalmente concebido como um meio para alcançar uma melhor imagem de vírus, congelar-fratura ganhou ainda mais popularidade como uma técnica para o exame e análise das membranas celulares e suas especializações ^{2, 3.} Na verdade, este procedimento tem sido parte integrante da elucidação das relações de estrutura / função em células e tecidos e muitos desses estudos se apresentam como contribuições clássicas para biologia celular e molecular ^4-9. O principal objetivo e justificativa para o desenvolvimento da técnica de congelamento e fratura era limitar artefatos observáveis ​​no elétron resolução microscópica decorrente da fixação química e processamento utilizado em microscopia eletrônica biológico convencional. Aqui o objectivo é limitar a químicaa fixação e para congelar as amostras com uma velocidade suficiente e muitas vezes na presença de um agente crioprotector de modo a limitar a formação de cristais de gelo e outros artefactos de congelamento. Mais recentemente, esta técnica tem encontrado um ressurgimento do interesse de biólogos moleculares e investigadores de ciência dos materiais para exame de nanopartículas e nanomateriais.

Freeze-fratura e congelar-etch imagens apresentam um caráter tridimensional e, por vezes, são confundidos com microscopia eletrônica de varredura. No entanto, os preparativos criofratura são examinados por microscopia eletrônica de transmissão e sua grande contribuição para os estudos morfológicos de alta resolução é a sua representação única de elementos estrutura / função das membranas celulares. Processamento de fractura por congelação é iniciada por células e tecidos de congelação com uma velocidade suficiente para limitar a cristalização do gelo e / ou com o uso de agentes crioprotectores, tais como glicerol. As amostras são então fraturado sob vácuo e um representantelica é gerado pela evaporação de carbono e platina sobre a superfície fracturada. A amostra original foi digerido a partir de réplicas, que é recuperado dentro de uma grade de amostra padrão EM. Outra má interpretação comum de imagens criofratura é que eles retratam superfícies celulares. No entanto, a premissa básica da congelação-fractura é que as membranas biológicas são divididos através da bicamada lipídica do processo de fractura (Figura 3). Este processo em membranas biológicas produz duas faces, uma fractura que revela a organização da metade da membrana adjacente ao citoplasma, o PF-cara, e uma que revela a metade do folheto bimolecular da membrana que está adjacente ao extracelular meio, a EF-face. Superfície das células não são verdadeiras imagens representadas em freeze-fracture mas só aparecem quando o passo subsequente adicionado de gelo-água-forte, seguindo o procedimento fractura é usado. A fim de gravar efetivamente espécimes previamente fraturadas para revelar detai superfíciel, as amostras devem ser congeladas a uma taxa rápida e sem unetchablecryoprotectant. Etching de água a partir da superfície do espécime fracturadas que revelem características subjacentes é conseguido através do posicionamento do braço micrótomo arrefecimento durante a fase de amostra criando um diferencial de temperatura entre a fase, com o modelo e o braço micrótomo de arrefecimento que faz com que a água a sublimar a partir da superfície. Quando a água é sublimada a partir da superfície do espécime fracturados durante a manobra de gravura congelação, em seguida, os aspectos de superfícies celulares reais, matriz extracelular, as estruturas do citoesqueleto e montagens moleculares pode ser revelada em alta resolução. Assim congelar-fratura e congelá-etch não são termos intercambiáveis ​​mas refletem um processo passo a passo o último dos quais pode não ser necessário ou desejável, dependendo das necessidades do estudo particular.

Após a fratura freeze / freeze-etch procedimentos, as superfícies fraturadas são submetidos a evapora dirigidostiva camadas de carbono e platina, a fim de fornecer suporte e imagem contraste com a réplica. A evaporação de imagem / carbono platina pode ser unidirecional ou rotativo, e é realizado por qualquer resistência ou canhões de elétrons. Sombreamento unidirecional de um ângulo conhecido, tipicamente 30 ° – 45 °, é útil na realização de certos cálculos morfométricos. As amostras que foram submetidas a deep-etching normalmente são rotativos sombreado e as imagens resultantes destes espécimes são fotograficamente revertida para avaliação.

O histórico, bem como uma meta presente da criofratura / congelar-etch técnica é limitar a fixação química e processamento das amostras de artefatos que estão associados com mais procedimentos de microscopia eletrônica de transmissão convencional. No entanto, esta técnica proporciona uma vantagem substancial em sua capacidade de conferir detalhe tridimensional e, assim, facilitar a aquisição de dados morfométricos em biológicas, ciência dos materiais, e nespécimes anotechnology. Procedimentos criofratura e congelar-etch são complexas e multi-facetada e alguns aspectos de sua aplicação são personalizados. Esta apresentação oferece uma visão levantamento das principais características do processo e remete-se a protocolos publicados abrangentes ^{10, 11} a fim de resolver os detalhes e personalizar o processo para as necessidades específicas de pesquisa.

Protocol

1 Preparação de amostras biológicas para Freeze-fratura / Freeze-etch Use uma formulação fixador EM convencional, tal como o glutaraldeído a 2% + 2% de paraformaldeído em tampão fosfato 0,1 M durante 1 hora. para realizar a fixação primária de tecidos biológicos. Nota: Embora possa ser desejável para congelar alguns tipos de amostras sem fixação prévia, de agentes patogénicos transmissíveis pelo sangue precauções universais obrigar a fixação adequada em que a amostra consiste de tecido h…

Representative Results

A premissa fundamental de interpretação da imagem criofratura é que planos de fratura atravessar a bicamada lipídica das membranas que conferem duas faces da fratura, chamado por convenção a PF-face (plasma fratura-face) e EF-face (extracelular fratura-face) (Figura 3). O PF-face é a metade da bicamada lipídica da membrana adjacente ao citoplasma da célula e o EF-face é a metade da bicamada lipídica da membrana adjacente ao meio extracelular. A técnica de congelação-fractura é particularm…

Discussion

Nos anos seguintes a sua introdução e disponibilidade comercial, congelar-fratura / procedimentos de corrosão foram amplamente utilizado em investigações da estrutura da membrana biológica. Na verdade, as melhores perspectivas de algumas das especializações estruturais das membranas foram obtidos em preparações criofratura / etch. Estes estudos não só contribuiu para a compreensão da organização estrutural das membranas mas também forneceu insights sobre como a estrutura ea função estão relacionados. …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant	Balzers	BAF400T
Standard buffers	various suppliers
standard aldehyde fixatives	various suppliers
sodium dichromate	various suppliers
sulfuric acid	various suppliers
Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation	Technotrade International
Liquid nitrogen	various suppliers
Freon	various suppliers
Disposable supplies for electron microscopy	Electron Microscopy Sciences
Transmission electron microscope	Carl Zeiss Inc.