Summary

Fundamental Teknisk Delar av Freeze-fraktur / Freeze-Etch i biologisk elektronmikroskopi

Published: September 11, 2014
doi:

Summary

Grundläggande tekniker och förfiningar av frysfraktur bearbetning av biologiska prover och nanomaterial för undersökning med transmissionselektronmikroskopi beskrivs. Denna teknik är en föredragen metod för att avslöja ultra funktioner och inriktningar av biologiska membran och för att erhålla dimension och rumsliga data ultra nivå inom materialvetenskap och nanoteknik produkter.

Abstract

Fryst fraktur / frysetsning beskriver en process där prover, vanligen biologisk eller nanomaterial i naturen, är frysta, sprucket, och replikeras för att generera ett kol / platina "cast" avsedd för undersökning med transmissionselektronmikroskop. Prover utsattes för ultrasnabba frysningshastigheter, ofta i närvaro av kryoskyddande medel för att begränsa iskristallbildning, med efterföljande sprickbildning av provet vid flytande kväve kylda temperaturer under högvakuum. Den resulterande brutna ytan replikeras och stabiliseras genom avdunstning av kol och platina från en vinkel som ger ytan tredimensionell detalj rösterna. Denna teknik har visat sig vara särskilt upplysande för utredning av cellmembran och deras inriktningar och har bidragit väsentligt till förståelsen av cellulära formen till relaterad cellfunktion. I denna rapport har vi kartlägga de krav organ och tekniska protokoll för att utförafrys fraktur, tillhörande nomenklatur och egenskaper sprickplan, variationer på det konventionella förfarandet, och kriterier för tolkning av fryst fraktur bilder. Denna teknik har använts i stor omfattning för ultra utredning inom många områden av cellbiologi och håller löftet som en framväxande bildteknik för molekylär, nanoteknik och material naturkunskap.

Introduction

Konceptet och praktisk tillämpning av frysfraktur bearbetning av biologiska prover introducerades av Steere 1 över ett halvt sekel sedan. Den tidiga apparater disponeras disparata delar till en fungerande självständig enhet 1. Den ursprungliga apparaten ändrades och förädlas till kommersiellt tillgängliga instrument för att tillgodose det stora behovet av fjärr manipulation, underhåll av högvakuum, och avdunstningen av kol och metaller för att producera en replik medger granskning av transmissionselektronmikroskop (Figur 1 och Figur 2).

Den typiska instrument består av en hög vakuumkammare med provbord och mikrotom arm som har reglerbara flytande kväve försäljning (Figur 1). Kammaren finns också två elektronkanoner, en för att stabilisera koldioxid avdunstning placerad i en 90 ° vinkel mot provstadiet och en för platinum / kol skuggning på en justerbar vinkel, vanligtvis 15 ° – 45 ° (Figur 2). Ström till enheten används för att driva vakuumpumpen och elektroniska paneler reglerar temperaturjustering och elektron vapenkontroll.

Ursprungligen tänkt som ett sätt att uppnå förbättrad avbildning av virus, frys fraktur vunnit ännu mer popularitet som en teknik för undersökning och analys av cellmembran och deras inriktningar 2, 3. I själva verket har detta förfarande varit integrerad belysa struktur / funktionssamband i celler och vävnader och många av dessa studier står som klassiska bidrag till cell och molekylärbiologi 4-9. Det främsta målet och logisk grund för utvecklingen av frysfraktur teknik var att begränsa artefakter observer på elektron mikroskopisk upplösning härrör från kemisk fixering och bearbetning som används i konventionell biologisk elektronmikroskopi. Här är målet att begränsa kemiskafixering och frysa provet med tillräcklig hastighet och ofta i närvaro av ett frysskyddsmedel för att begränsa iskristallbildning och andra frysning artefakter. På senare tid har denna teknik hittat ett återuppvaknande av intresse från molekylärbiologer och materialvetenskapliga utredare för undersökning av nanopartiklar och nanomaterial.

Frystfraktur och frystetsning bilderna uppvisar en tredimensionell karaktär och ibland misstar för svepelektronmikro. Men fryst fraktur preparat undersöktes med transmissionselektronmikroskop och deras viktiga bidrag till högupplösta morfologiska studier är deras unika representation av strukturen / funktions delar av cellmembran. Frys-fraktur behandling initieras genom frysning celler och vävnader med tillräcklig hastighet för att begränsa is kristallisation och / eller med användning av kryoskyddande medel, såsom glycerol. Proverna sedan splittrade under vakuum och ett replica alstras genom förångning av kol och platina över brottyta. Den ursprungliga exemplaret rötas från kopian som hämtas på en standard EM prov nätet. En annan vanlig feltolkning av frystbrott bilder är att de skildrar cellytor. Men den grundläggande förutsättningen för frys fraktur är att biologiska membran är uppdelade genom membranet genom processen fraktur (Figur 3). Denna process i biologiska membran ger två brottytor, en som visar organisationen av hälften av membranet intill cytoplasman, PF-ansikte, och ett som avslöjar halva bimolekylära broschyr av membranet som ligger i anslutning till den extracellulära milieu, EF-ansikte. Sanna cellytor ingår inte i fryst fraktur bilder utan bara visas när det efterföljande lagt steget frys etsning enligt proceduren fraktur används. För att effektivt etsa tidigare brutna prover för att avslöja yta detail, skall proverna frysas i snabb takt och utan unetchablecryoprotectant. Etsning av vatten från ytan av de brutna provet avslöjar underliggande funktioner åstadkoms genom att placera avkylning mikrotomen armen över provet scenen skapar en temperaturskillnad mellan scenen som håller provet och kylnings mikrotomen arm som gör att vattnet sublimera från ytan. När vatten sublimeras från ytan av de brutna provexemplar under frysetsning manöver, då aspekter av faktiska cellytor, extracellulär matris, cytoskelettala strukturer och molekylära aggregat kan avslöjas med hög upplösning. Således frysfraktur och frys Etch inte utbytbara termer, utan snarare återspeglar en stegvis process den senare som kanske inte är nödvändigt eller önskvärt, beroende på behoven hos den specifika studien.

Efter frysfraktur / frysetsningsförfaranden är de brutna ytorna utsätts för riktade evaporativ rockar av kol och platina i syfte att tillhandahålla stöd och avbildning kontrast till repliken. Den platina / kol imaging avdunstning kan vara enkelriktad eller roterande och åstadkommes genom antingen motstånd eller elektronkanoner. Enkelriktad skuggning från en känd vinkel, vanligtvis 30 ° – 45 °, är användbar för att utföra vissa morfometriska beräkningar. Prover som har utsatts för djup etsning är typiskt rotations skuggad och de resulterande bilderna av dessa prover är fotografiskt återförs för utvärdering.

Den historiska såväl som present mål i frysfraktur / frysetsningstekniken är att begränsa kemisk fixering och bearbetning exemplar artefakter som är associerade med mer konventionella transmissionselektronmikroskopi förfaranden. Dock ger denna teknik en materiell fördel i sin förmåga att ge tredimensionella detaljer och därmed underlätta förvärv av morfometriska data i biologiska, materialvetenskap, och nanotechnology prover. Frystfraktur och fryst etsning förfarandena är komplexa och mångfacetterade, och vissa aspekter av dess tillämpning är anpassade. Denna presentation ger en översikt bild av de viktigaste egenskaperna hos processen och läsaren hänvisas till omfattande publicerade protokoll 10, 11 för att ta itu med detaljerna och anpassa processen för specifika forskningsbehov.

Protocol

1 Beredning av biologiska prov för Freeze-fraktur / Freeze-Etch Använd en konventionell EM fixativ formulering såsom 2% glutaraldehyd + 2% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffert under 1 tim. att utföra primär fixering av biologiska vävnader. OBS: Även om det kan vara önskvärt att frysa vissa typer av prover utan föregående fixering, universella blodburna patogener försiktighetsåtgärder mandat lämplig fixering om exemplaret består av mänsklig vävnad. Efter primär fixering, skölj f?…

Representative Results

Nyckel förutsättningen för frysfrakturbild tolkning är att sprickplan passerar genom membranet av membran som ger två brottytor, kallas av konventionen PF-face (plasma fraktur ansikte) och EF-face (extracellulärt fraktur ansikte) (Figur 3). PF-ansikte är det halv membranets lipiddubbelskikt angränsande till cytoplasman av cellen och EF-ansikte är det halv membranets lipiddubbelskikt angränsande till den extracellulära miljön. Den fryst fraktur tekniken är särskilt användbar för undersök…

Discussion

Under åren efter dess införande och kommersiell tillgänglighet, frys fraktur / etsningsförfaranden allmänt används för undersökningar av biologiskt membran struktur. I själva verket har de bästa utsikterna för en del av de strukturella specialiseringar av membran erhållits i beredningar frysfraktur / etsnings. Dessa studier inte bara bidragit till förståelsen av organisationsstruktur membran utan också insikter i hur struktur och funktion är relaterade.

Tillkomsten av rutinen…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This presentation was supported by a Clinical Innovator Award to JLC from the Flight Attendant Medical Research Institute and by the United States Environmental Protection Agency. Although the research described in this article has been funded wholly or in part by the United States Environmental Protection Agency through Cooperative Agreement CR83346301 with the Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology at The University of North Carolina at Chapel Hill, it has not been subjected to the Agency’s required peer and policy review, and therefore does not necessarily reflect the views of the Agency and no official endorsement should be inferred. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant Balzers BAF400T
Standard buffers various suppliers
standard aldehyde fixatives various suppliers
sodium dichromate various suppliers
sulfuric acid various suppliers
Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation Technotrade International
Liquid nitrogen various suppliers
Freon various suppliers
Disposable supplies for electron microscopy Electron Microscopy Sciences
Transmission electron microscope Carl Zeiss Inc.

Referências

  1. Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).
  2. Pinto da Silva, P., Branton, D. Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker. J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).
  3. Friend, D. S., Gilula, N. B. Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues. J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).
  4. Branton, D. Fracture faces of frozen membranes. ProcNatlAcadSci USA. 55, 1048-1056 (1966).
  5. Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release. J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).
  6. Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella. J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).
  7. Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of the outer dynein arm. J Cell Biol. 95, 798-815 (1982).
  8. Hirokawa, N., Heuser, J. E. Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells. J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).
  9. Hirokawa, N. Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton. Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).
  10. Chandler, D. E., Sharp, W. P., Kuo, J. o. h. n. Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1117, 95-132 (2014).
  11. Severs, N. J. Freeze-fracture electron microscopy. Nature Protocols. 2, 547-576 (2007).
  12. Gilula, N. B., Satir, P. The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization. J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).
  13. Rohatgi, R., Snell, W. J. The ciliary membrane. CurrOpin Cell Biol. 22, 541-546 (2010).
  14. Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future. Biol Cell. 103, 249-270 (2011).
  15. Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium. Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).
  16. Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture. J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).
  17. Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets. Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).
  18. Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability. Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).
  19. Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro. J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).
  20. Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study. Am J Anat. 173, 257-268 (1985).
  21. Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells. J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).
  22. Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
  23. Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions. Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).
  24. Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium. Am J Respir Cell & Molec Biol. 1, 385-390 (1989).
  25. Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection. Science. 206, 349-351 (1979).
  26. Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease. Infect & Immun. 29, 1117-1124 (1980).
  27. Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung. J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).
  28. Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure. Environ Res. 42, 155-165 (1987).
  29. Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis. Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).
  30. Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke. InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).
  31. Boonstra, J., et al. Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture. J Microscopy. 140, 119-129 (1985).
  32. Fujimoto, K. Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes. J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).
  33. Quinn, P. J. The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes. J Control Release. 160, 158-163 (2012).
check_url/pt/51694?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Carson, J. L. Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51694, doi:10.3791/51694 (2014).

View Video