अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए संग्रह और लार के डीएनए निष्कर्षण
Summary
DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.
Abstract
The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.
Introduction
मानव आनुवंशिक अध्ययन के लिए उच्च गुणवत्ता डीएनए प्राप्त रोग जीन की खोज की प्रक्रिया में आवश्यक है. रक्त, लार संग्रह से अधिक महंगा होने के भी एक आक्रामक प्रक्रिया की आवश्यकता होती है और हालांकि, कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक अनंत डीएनए के स्रोत, या IPSCs के रूप में अमर सेल लाइनों बनाने के लिए इष्ट है, और सेल लाइनों उपलब्ध नहीं हैं कभी कभी जब रक्त डीएनए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, रक्त प्राप्त करने के लिए एक प्रशिक्षित phlebotomist की आवश्यकता है और रक्त लार 1 से एक कम आधा जीवन है. इसे एकत्र और इस तरह अच्छी तरह से अस्पतालों और प्रयोगशालाओं 2 के जलग्रहण क्षेत्र से परे संभावित विषय पूल में वृद्धि, एक phlebotomist के लिए आवश्यकता के बिना मेल के माध्यम से भेजा जा सकता है के बाद से लार से डीएनए प्राप्त करने के लिए कम खर्चीला और आसान है. विषयों के बजाय खून 3, 4 के लार का नमूना देने का विकल्प होता है जब अध्ययन नामांकन में सुधार किया जा सकता है. मात्रा और लार से डीएनए की गुणवत्ता के बारे में चिंताएं हमें इसके व्यापक सीमित हो सकता हैलार 2, 3, 4, 5 के महत्वपूर्ण मात्रा में प्राप्त नहीं किया था कि पुराने मुख swabs तरीकों पर डीएनए परीक्षण के लिए मिली लीटर प्रति 4.3 x 10 5 कोशिकाओं के एक औसत के साथ, पूरे लार की उपयुक्तता दिखा कई अध्ययनों से हाल ही के अध्ययन के बावजूद ई, 6. एक मामूली साहित्य माइक्रोएरे आधारित विधियों 8, सहित जीनोटाइपिंग अनुप्रयोगों के लिए पूरे लार व्युत्पन्न डीएनए की उपयुक्तता दिखा मौजूद है जबकि 9, 10, कोई पढ़ाई की जांच की है अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS). इस पूरे लार डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए लक्ष्य को आसानी से आम अभिकर्मकों और उपभोग्य साथ प्रयोगशालाओं में कार्यान्वित किया जाता है कि एक लागत प्रभावी तरीके से आनुवंशिकी अनुप्रयोगों के लिए मात्रा और गुणवत्ता को अधिकतम करने के लिए किया गया था.
लार से डीएनए निष्कर्षण कई प्रक्रियाओं की आवश्यकता है: 1) संग्रह और भंडारण, 2) सेल, 3) RNase उपचार, 4) प्रोटीन वर्षा, 5) इथेनॉल वर्षा, 6) डीएनए पुनर्जलीकरण. वर्णित डीएनए स्थिरीकरण बफर समाधान,पहले 2, पर्याप्त रूप से परिवर्तन के बिना काम करता है. RNase उपचार और डीएनए पुनर्जलीकरण कदम अनुकूलन करने के लिए कोई प्रयास नहीं किया गया था. प्रत्येक शेष कदम के लिए, उपज प्रभावित हो सकता है कि कई चर की पहचान की गई. प्रत्येक चर व्यक्तिगत रूप से चालाकी से किया गया था और उपज और गुणवत्ता में सुधार के लिए सांख्यिकीय मूल्यांकन किया गया था. उपज और / या डीएनए की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए दिखाया गया है कि चर के लिए, इष्टतम मूल्यों अंतिम प्रोटोकॉल में शामिल थे.
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान प्रक्रिया काफी डीएनए गुणवत्ता से समझौता किए बिना, मानक तरीकों की तुलना में उच्च आणविक वजन डीएनए की उपज में सुधार हुआ है कि एक अनुकूलित डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल है. उपज अधिकांश पर सबसे बड़ा प्?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a National Institutes of Health R01 (DC009453 support to CWB).
Materials
| 15ml Centrifuge Tubes | Fisher | 12-565-268 |
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 |
| Proteinase K | Sigma | P6556 |
| Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 |
| Glycogen | EZ-BioResearch | S1003 |
| 70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 |
| NaCl | Fisher | AC194090010 |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 |
| EDTA(0.5M) Solution | Fisher | 03-500-506 |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 |
| Equipment | ||
| Name of Equipment | Distributor | Catalog# |
| Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-365 |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
Referências
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