Microescala Electroporator para entrega Sequential Molecular assistida por Vortex
Summary
Um vórtice microfluídico plataforma eletroporação assistida foi desenvolvido para entrega seqüencial de múltiplas moléculas em populações de células idênticas, com controle de dosagem precisa e independente. Tamanho com base etapa de purificação de células alvo eletroporação anterior do sistema auxiliado para aumentar a eficiência de entrega molecular e viabilidade celular processado.
Abstract
A electroporação tem recebido crescente atenção nos últimos anos, porque é uma técnica muito potente para a introdução de sondas moleculares exógenas fisicamente não permeantes em células. Este trabalho apresenta uma plataforma microfluídica eletroporação capaz de realizar múltiplas entrega molécula para células de mamíferos com controle de parâmetro preciso e molecular dependente. A capacidade do sistema para isolar células com distribuição de tamanho uniforme permite menos variação na eficiência eletroporação per dada intensidade do campo elétrico; por conseguinte, melhorada a viabilidade da amostra. Além disso, o recurso de visualização do processo permite a observação do processo molecular fluorescente captação em tempo real, que permite ajustes de parâmetros entrega moleculares rápidas in situ para aumento de eficiência. Para mostrar as vastas capacidades da plataforma relatado, macromoléculas com diferentes tamanhos e cargas elétricas (por exemplo, dextrano com MW de 3.000 e 70.000 Da) foramentregues para as células do câncer de mama metastático com alta eficiência de entrega (> 70%) para todas as moléculas testadas. A plataforma desenvolvida provou o seu potencial para uso na expansão de campos de pesquisa onde on-chip técnicas de eletroporação pode ser benéfico.
Introduction
Nos últimos anos, a utilização de impulsos eléctricos para facilitar a entrega de moléculas extracelulares citosólica tornou-se um meio atractivo de manipulação de células de mamífero. Uma Este processo, também conhecido como electroporação, reversivelmente, permeabiliza a membrana celular, permitindo que as moléculas de membrana inerentemente impermeáveis para aceder ao meio intracelular das células. Como virtualmente qualquer molécula pode ser introduzida no citossol através de poros criados temporárias na membrana de qualquer tipo de células, utilizando a electroporação, a técnica tem sido relatada como sendo mais reprodutível, de aplicação universal, e mais eficiente do que outros métodos, incluindo mediada por vírus, química e abordagens ópticos 2-3. Esta técnica tem sido utilizada para introduzir moléculas fluorescentes, 4 drogas 5 e ácidos nucleicos de 6-7, mantendo as células viáveis e intacta. Dadas essas vantagens, eletroporação foi adotado como um trabalho comumtória técnica para a transfecção de ADN, a terapia de genes in vivo e 8 estudos de vacinação celular. É, no entanto, continua a ser difícil para os sistemas convencionais de electroporação para conseguir simultaneamente a eficiência prática e viabilidade para as amostras com grande heterogeneidade no tamanho, porque a intensidade do campo eléctrico necessário para electroporação bem sucedida se correlaciona intimamente com o diâmetro da célula. Além disso, esses sistemas não permitem um controle preciso das quantidades moleculares múltiplas sendo entregues devido à dependência do processo de entrega molecular estocástico granel. 9 A fim de abordar estas questões, muitos grupos desenvolveram plataformas eletroporação microfluídicos, oferecendo a vantagem de tensões formadores de poros menores, melhor eficiência de transfecção, uma grande redução na mortalidade celular e capacidade de oferecer várias moléculas. foram possíveis devido às pequenas pegadas de sistemas de eletroporação em microescala cujo eletrodo passo 10-13 Estas vantagenscomprimentos são sub-milímetros, diminuindo drasticamente as tensões necessárias para entrega bem sucedida. Além disso, esses sistemas de eletroporação em microescala pode alcançar distribuição de campo elétrico uniforme e rapidamente dissipa o calor gerado, produzindo mortalidade celular reduzida, reforçando simultaneamente a eficiência de entrega. A utilização de materiais transparentes para estas micropastilhas permite ainda na observação in situ do processo de modificações dos parâmetros de electroporação rápidas. 2,12 Contudo, o controlo de dosagem precisa e controlo do parâmetro molecular-celular e dependente, necessária para a pesquisa e aplicações terapêuticas, 6 emergente, 14-16 continuam por resolver.
Este trabalho apresenta um sistema de eletroporação microfluídica assistida por vórtice, capaz de oferecer múltiplas moléculas sequencialmente em uma população idêntica pré-selecionado de células-alvo. As células com a distribuição de tamanho uniforme são isolados antes de electroporação utilizando si previamente relatadomecanismo de ze-seletiva trapping. 17-18 Por ter uma distribuição uniforme tamanho, menor variação na eficiência eletroporação e maior viabilidade por determinado intensidade do campo elétrico foram atingidos. 19 Além disso, continuamente agitando células presos usando vórtices microescala permitido para entrega uniforme de moléculas através da citosol inteiro, de acordo com os resultados relatados anteriormente usando uma outra plataforma electroporação assistida por vórtice. 20 Para demonstrar que este sistema pode ser aplicado a uma ampla gama de moléculas comumente utilizados em aplicações biológicas, macromoléculas com uma ampla gama de pesos moleculares foram entregues aos células de câncer de mama metastático. Além disso, com a ajuda de monitoramento de processos em tempo real, este trabalho fornece mais evidências para pôr fim ao debate de longa data sobre o mecanismo de entrega molecular durante electrporation, sendo predominantemente eletroforese mediada versus 14 mediada por difusão. </sup> Ao contrário de outros sistemas de electroporação, esta plataforma fornece exclusivamente as vantagens combinadas de precisão de entrega multi-molécula, de alta eficiência de entrega molecular, a mortalidade celular mínimo, um período largo de tamanho e taxas de moléculas entregues, bem como a visualização em tempo real da electroporação processo. Dadas estas capacidades, o sistema de eletroporação desenvolvido tem potencial prático como uma ferramenta versátil para estudos de reprogramação celular, aplicativos de entrega de drogas 6,14,21-22 10,19 e aplicações que requerem para a compreensão em profundidade dos mecanismos moleculares de entrega eletroporação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Com a nova plataforma eletroporação paralelizado, o aumento de 10 vezes na produtividade e eficiência da prestação de multi-molécula foi alcançado, além de todas as vantagens que o sistema de câmara única previamente desenvolvido proporciona. 18 méritos Anteriormente disponíveis incluem: (i) pré-purificação de as células alvo e com distribuição uniforme de tamanho de reforço viabilidade, (ii) o controlo de dosagem molecular preciso e individual, e (iii) a partir de corrente eléctrica opera…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo programa Rowland Júnior Fellow. Os autores gostariam de expressar gratidão aos cientistas e funcionários do Instituto Rowland em Harvard: Chris Stokes a sua ajuda para o desenvolvimento da, configuração de controle de pressão assistida por computador custom-built, Diane Schaak, Ph.D. por sua entrada para a manipulação de amostra biológica, Winfield Hill para o desenvolvimento da instalação elétrica, Alavaro Sanchez, Ph.D. para a concessão de acesso ao citômetro de fluxo, Scott Bevis, Kenny Spencer e Don Rogers para a usinagem de componentes hidráulicos mecânicos necessários para a configuração de pressão. Mestres microfluídicos foram fabricados no Centro de Sistemas em nanoescala (CNS) na Universidade de Harvard.
Materials
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| high-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32"ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluiminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 mL centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
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