Tableau hybridation génomique comparative (CGH array) pour la détection des variantes génomiques du nombre de copies
Summary
CGH array pour la détection des variantes du nombre de copies génomiques a remplacé l'analyse du caryotype G-bandes. Cet article décrit la technologie et son application dans un laboratoire de services de diagnostic.
Abstract
Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient’s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.
Introduction
Il a été connu depuis de nombreuses années que les suppressions ou des copies supplémentaires de segments chromosomiques causent une déficience intellectuelle, une dysmorphie et des malformations congentical, et dans certains cas provoquer des syndromes génétiques 1. Cependant, la seule technologie disponible jusqu'au milieu des années 2000 pour la détection du génome entier de ces changements était G-bandes analyse des chromosomes, qui a une résolution de l'ordre 5-10Mb, selon la région et la nature du déséquilibre, et qui ne peut pas détecter chromosomes anormaux où la matière a été remplacé par une région d'un chromosome différent avec le même motif de bandes. Techniques cytogénétiques auxiliaires tels que l'hybridation fluorescente in situ et multiplex sonde amplification spécifique de ligature pt ont été disponibles pour l'interrogation des loci spécifiques, en cas de suspicion déséquilibre syndromique spécifique, mais ce ne est que l'introduction d'hybridation génomique comparative (CGH array) en s diagnostic clinique de routineervice 2-5 que la détection du génome entier du nombre de copies variantes (CNV) est devenu possible à une résolution considérablement augmenté (généralement autour de 120kb). Travaux de service clinique parallèlement à des études de recherche ont montré que CNV pour certaines régions sont très répandues dans la population normale 6-7, tandis que d'autres CNV, auparavant indétectable, sont associés à neurodisabilities comme l'autisme et l'épilepsie 8-11.
Le protocole décrit dans ce document est utilisé dans notre laboratoire de diagnostic clinique UK National Health Service (NHS); nous utilisons de nouvelles stratégies d'hybridation, les tests par lots et de la robotique de minimiser les coûts de ce service financé par l'Etat.
Avant le protocole détaillé ci-dessous, l'ADN de haute qualité doit être extraite de la matière de départ appropriée, habituellement du sang, des cellules cultivées ou des échantillons de tissus. Spectrophotométrie peut être utilisé pour mesurer la concentration (devrait être> 50 ng / ul) et vérifier 260: 280 rapports d'absorbance (b devraite 1,8 à 2,0). L'électrophorèse sur gel peut être utilisée pour vérifier que l'ADN soit de haut poids moléculaire sans dégradation significative.
Ce protocole est conçu pour les laboratoires de débit plus élevés qui sont étiquetage 96 échantillons par exécution à l'aide automatisés robotique de manipulation de liquides. Cependant, il peut être adapté pour les laboratoires de débit inférieurs sans automatisation.
Protocol
Representative Results
Discussion
CGH array ne détectera pas remaniements équilibrés ou des anomalies de ploïdie tels que la triploïdie. En outre, les déséquilibres mosaïque de bas niveau ne peuvent pas être détectés. Cependant, CGH array a une résolution plus élevée pour la détection CNV que l'analyse des chromosomes bandes G laquelle il a remplacé dans de nombreux laboratoires de cytogénétique. Ce est donc la norme de référence actuelle pour la détection du génome entier CNV. Elle peut être remplacée par des technologies de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| CGH microarray 8 x 60K | Agilent | G4126 | |
| Array CGH wash buffers | Agilent | 5188-5226 | |
| Array CGH hybridisation buffer | Agilent | 5188-5380 | |
| Minelute purification kit | Qiagen | 28006 | |
| Array CGH labelling kit | Enzo | ENZ-42672-0000 |
Referências
- Miller, D. T., et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).
- Ahn, J. W., et al. Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals – results from four years’ clinical application for over 8,700 patients. Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).
- Ahn, J. W., et al. Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance. Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).
- Beaudet, A. L. The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics. Child Dev. 84, 121-132 (2013).
- Park, S. J., et al. Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases. Mol. Cytogenet. 4, 12 (2011).
- Iafrate, A. J., et al. Detection of large-scale variation in the human genome. Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).
- Redon, R., et al. Global variation in copy number in the human genome. Nature. 444, 444-454 (2006).
- Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome. Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).
- Molin, A. M., et al. A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features. J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).
- Tropeano, M., et al. Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders. PLoS One. 8, e61365 (2013).
- Bon, B. W., et al. Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome. J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).
