संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं में व्यापक समानांतर रिपोर्टर Assays

Summary

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Abstract

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

Introduction

व्यापक समानांतर रिपोर्टर assays (एम पी आर ए) डीएनए दृश्यों ^{1 7} के हजारों की सैकड़ों करने के लिए हजारों की विनियामक गतिविधियों की मल्टिप्लेक्स माप अनुमति देते हैं. उनकी सबसे आम कार्यान्वयन में, बहुसंकेतन एक खुला पढ़ने फ्रेम के नीचे की ओर एक पहचान अनुक्रम टैग है कि एक सिंथेटिक रिपोर्टर जीन के लिए ब्याज की प्रत्येक अनुक्रम युग्मन द्वारा हासिल की है (ओआरएफ, चित्रा 1). अभिकर्मक, शाही सेना अलगाव और पत्रकार जीन टेप के 3 'सिरों की गहरी अनुक्रमण के बाद, युग्मित दृश्यों के सापेक्ष गतिविधियों उनकी पहचान टैग के रिश्तेदार बहुतायत से निष्कर्ष निकाला जा सकता है.

एम पी आर ए चित्रा 1 अवलोकन. एम पी आर ए संवाददाता के एक पुस्तकालय सिंथेटिक लिए ख्यात विनियामक दृश्यों युग्मन द्वारा निर्माण किया है constructsएक की पहचान अनुक्रम टैग द्वारा पीछा (जैसे GFP या luciferase के रूप में) एक "निष्क्रिय" ओआरएफ से मिलकर उस रिपोर्टर जीन. पुस्तकालय संवर्धित कोशिकाओं की आबादी में सामूहिक रूप से ट्रांसफ़ेक्ट है और लिखित संवाददाता mRNA के बाद बरामद किया है. गहरी अनुक्रमण संवाददाता mRNAs और ट्रांसफ़ेक्ट plasmids के बीच एक टैग की घटनाओं की संख्या गिनने के लिए प्रयोग किया जाता है. प्लाज्मिड मायने रखता है इसी विनियामक अनुक्रम की गतिविधि अनुमान किया जा सकता से अधिक mRNA की अनुपात में गिना जाता है. Melnikov से अनुमति के साथ अनुकूलित, एट अल ^2.

एम पी आर ए ब्याज का एक ठिकाना भर उपन्यास नियामक तत्वों के लिए व्यक्तिगत जीन नियामक तत्वों का 1) व्यापक उत्परिवर्तजनन, 2) स्कैनिंग सहित, प्रयोगात्मक डिजाइन की एक विस्तृत विविधता के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, 3) ख्यात का एक सेट में प्राकृतिक आनुवंशिक परिवर्तन के प्रभाव का परीक्षण प्रमोटरों, enhancers या साइलेंसर, और सिंथेटिक नियामक तत्वों की 4) अर्द्ध तर्कसंगत इंजीनियरिंग. लीअनुक्रम वेरिएंट की braries पतित oligonucleotides ^1,4, मिश्रित बंधाव ⁸ और जीनोमिक डीएनए ⁵ के विखंडन की oligonucleotide पुस्तकालय प्रोग्राम प्रोटीन ^2,3,6,7 पर संश्लेषण (OLS), विधानसभा सहित तरीकों की एक किस्म का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता.

इस प्रोटोकॉल प्रमोटर के एक पुस्तकालय का निर्माण का वर्णन वेरिएंट OLS और pMPRA1 और pMPRAdonor1 वैक्टर (क्रमशः Addgene आईडी 49349 और 49352,; http://www.addgene.org) का उपयोग कर, सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं और बाद quantitation में इस पुस्तकालय के क्षणिक अभिकर्मक उनके संबद्ध टैग की गहरी अनुक्रमण (टैग Seq) द्वारा प्रमोटर गतिविधियों की. इस प्रोटोकॉल के पिछले संस्करण (2013) शोध 23, 800-811 Melnikov एट अल. नेचर बायोटेक्नोलॉजी 30, 271-277 (2012) में और Kheradpour एट अल. जीनोम में रिपोर्ट अनुसंधान में इस्तेमाल किया गया.

Protocol

1 अनुक्रम डिजाइन और संश्लेषण दृश्यों के डिजाइन और संश्लेषण के साथ एम पी आर ए शुरू नियामक गतिविधि के लिए assayed हो. PMPRA वेक्टर श्रृंखला के साथ संगतता के लिए निम्न टेम्पलेट का उपयोग कर प्रत्येक दृश्य डिजाइन: 5'-ACTGGCCGCTTCACTG- वर -GGTACCTCTAGA- टैग -AGATCGGAAGAGCGTCG -3 वर assayed हो अनुक्रम अर्थ और टैग एक या एक से अधिक पहचान टैग जहां अर्थ '. दो चर क्षेत्रों (वर और टैग) उन दोनों के बीच एक पत्रकार जीन टुकड़ा की दिशात्मक बंधाव की सुविधा के लिए KpnI (GGTACC) और XbaI (TCTAGA) प्रतिबंध साइटों की एक जोड़ी से अलग होती है. इसके अलावा, दो अलग SfiI (GGCCNNNNNGGCC) साइटों pMPRA रीढ़ में दिशात्मक बंधाव अनुमति देने के लिए पीसीआर से जोड़ दिया जाएगा. चर क्षेत्रों ये प्रतिबंध साइटों में से किसी की अतिरिक्त प्रतियां नहीं होनी चाहिए. यदि आवश्यक हो, इन प्रतिबंध एंजाइमों के एक या एक से अधिक बदला जा सकता है, के रूप में लंबे समय के प्रतिस्थापन के रूप में 1) करीब डीएनए अणु के छोर तक कुशल काटने की अनुमति है, और 2) वेक्टर अनुक्रम में कहीं काट नहीं है. अतिरिक्त जानकारी के लिए चर्चा देखें. एक वाणिज्यिक विक्रेता से 1 टेबल में सूचीबद्ध आवश्यक प्राइमरों प्राप्त करते हैं. MPRA_SfiI_F GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG MPRA_SfiI_R GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC TAGseq_P1 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT TAGseq_P2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [सूचकांक] जी.टी. GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG तालिका 1 प्राइमर दृश्यों. [सूचकांक] मल्टिप्लेक्स अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल एक 6 से 8 NT सूचकांक अनुक्रम अर्थ. विभिन्न सूचकांकों के साथ कम से कम 8 TagSeq-P2 प्राइमरों प्राप्त करते हैं. सभीप्राइमरों की HPLC या पृष्ठ द्वारा शुद्ध किया जाना चाहिए. प्रोटोकॉल पुस्तकालयों एक वाणिज्यिक विक्रेता या कोर सुविधा से प्राप्त, या निर्माता द्वारा वर्णित के रूप में एक प्रोग्राम माइक्रोएरे आधारित oligonucleotide सिंथेसाइज़र का उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकता है. 100 μl ते 0.1 बफर में OLS उत्पादों Resuspend. Polyacrylamide जेल denaturing एक 10% TBE-यूरिया पर oligonucleotide पुस्तकालयों चलाएँ. उनकी गुणवत्ता (2A चित्रा) का आकलन करने के लिए ssDNA के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट दाग के साथ लेन और दाग के अनुसार लगभग 1 pmol लोड करें. पूर्ण लंबाई oligonucleotides को इसी एक असतत बैंड देखे जा सकते हैं (चित्रा 2A, गलियों 1 और 2), इसी acrylamide जेल टुकड़ा उत्पाद शुल्क और झटकों के साथ रात भर कमरे के तापमान पर 100 μl ते 0.1 में oligonucleotides elute. अन्यथा, कच्चे OLS निलंबन का उपयोग कर आगे बढ़ें. बढ़ाना और पीसीआर 9 पायस का उपयोग oligonucleotide पुस्तकालय को SfiI पूंछ जोड़ </ > समर्थन. तालिका 2 में वर्णित के रूप में 50 μl पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण सेट करें. तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 μl Micellula डीएनए इमल्शन से तेल और surfactant मिश्रण और शोधन किट और भंवर के साथ गठबंधन. अभिकर्मक 1x मात्रा (μl) Herculase द्वितीय फ्यूजन डीएनए पोलीमरेज़ 0.5 5x Herculase द्वितीय प्रतिक्रिया बफर 10 dNTP (10 मिमी प्रत्येक) 1.25 बीएसए (20 मिलीग्राम / एमएल) 1.25 प्राइमर MPRA_SfiI_F (25 माइक्रोन) 0.25 प्राइमर MPRA_SfiI_R (25 माइक्रोन) 0.25 OLS टेम्पलेट (1-10 attomol) बदलता है Nuclease मुक्त पानी 50 को ve_content "> तालिका 2 इमल्शन पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण (पानी चरण). कलाकृतियों की उपस्थिति के बिना प्रवर्धन उत्पादों की अधिक से अधिक उपज देता है कि एकाग्रता का उपयोग करें (खंड 1.12 देखें). पीसीआर ट्यूबों में जिसके परिणामस्वरूप पायस बांटना और 95 डिग्री सेल्सियस (2 मिनट पीसीआर की 20 चक्र प्रदर्शन, 20 एक्स [95 डिग्री सेल्सियस पर 20 सेकंड, 55 डिग्री सेल्सियस, 72 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड में 20 सेकंड], 95 पर 3 मिनट डिग्री सेल्सियस). पूल vortexing संक्षिप्त 1 मिलीलीटर isobutanol जोड़ने और से प्रत्येक 350 μl पायस पीसीआर प्रतिक्रिया तोड़ने, और फिर एक डीएनए शुद्धि स्तंभ का उपयोग प्रवर्धन उत्पाद शुद्ध और. Artifact मुक्त प्रवर्धन (चित्रा 2 बी) को सत्यापित करने के लिए एक 2% या 4% agarose जेल पर एक विभाज्य चलाएँ. Oligonucleotide संश्लेषण पुस्तकालयों की चित्रा 2 तैयारी. ए) </sटुनिशिया> तीन अलग कच्चे oligonucleotide संश्लेषण पुस्तकालयों (OLS) 10% TBE-यूरिया polyacrylamide जैल denaturing पर चलाते हैं. पूरी लंबाई oligonucleotides (*) के लिए इसी बैंड कल्पना और पुस्तकालयों 1 से excised और 2 लाइब्रेरी 3 page शुद्धि के साथ हस्तक्षेप कि contaminants शामिल किया जा सकता है. यदि यह मामला है, एक agarose जेल पर एक ही oligonucleotide पुस्तकालय चलाने के खुले और पायस पीसीआर प्रवर्धन की पीसीआर प्रवर्धन. बी) उत्पाद को सीधे आगे बढ़ना. जटिल oligonucleotide पुस्तकालयों की पीसीआर प्रवर्धन अक्सर काइमेरिक उत्पादों और उच्च और निम्न बैंड के रूप में प्रकट हो सकता है कि अन्य कलाकृतियों बनाता है. इमल्शन पीसीआर इन कलाकृतियों को कम कर सकते हैं. 2 लाइब्रेरी निर्माण एक 1% agarose जेल पर चलने 2 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर SfiI साथ पचा वेक्टर pMPRA1 द्वारा एक linearized प्लाज्मिड रीढ़ की तैयारी (इस मामले, 2.5 KB में) रीढ़ बैंड उत्पाद शुल्क और एक जेल शुद्धि स्पिन स्तंभ का उपयोग कर यह शुद्ध. डाइजेस्ट2 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर SfiI साथ कदम 1.4 से पायस पीसीआर उत्पादों और डीएनए शुद्धि स्तंभों का उपयोग शुद्ध. , Linearized वेक्टर रीढ़ की हड्डी में प्रमोटर टैग पुस्तकालय ligate के लिए पचा पीसीआर उत्पाद के 100 एनजी, linearized वेक्टर रीढ़ की हड्डी और टी -4 डीएनए ligase के 50 एनजी युक्त प्रतिक्रियाओं की स्थापना की. 20 मिनट ligase निष्क्रिय करने के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर तो गर्मी 16 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं और. ई रूपांतरण बंधाव प्रतिक्रिया के साथ कोलाई. पुस्तकालय जटिलता को संरक्षित करने के लिए डिजाइन, पुस्तकालय में अलग प्रमोटर टैग संयोजन कर रहे हैं की तुलना में कम से कम 10x अधिक CFU प्राप्त करना है. टैग की कुल संख्या लगभग 100,000 है, जब लक्ष्य CFU आमतौर पर पुस्तकालय प्रति 6-8 समानांतर परिवर्तनों के प्रदर्शन से हासिल किया जा सकता है. प्रत्येक परिवर्तन के लिए, ई electrocompetent 50 μl गठबंधन बर्फ पर बंधाव मिश्रण के 2 μl साथ कोलाई कोशिकाओं. 800 μl समाज में कोशिकाओं, electroporation द्वारा रूपांतरण की वसूलीसमानांतर परिवर्तनों से कोशिकाओं गठबंधन तो 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए, और द्वारा मध्यम. परिवर्तन दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए, 50-100 माइक्रोग्राम / एमएल कार्बेनिसिलिन साथ लेग अगर प्लेटों पर बरामद कोशिकाओं की एक alinquot से धारावाहिक dilutions प्लेट और रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस सेते हैं. / वी, वी बरामद कोशिकाओं और वी की कुल मात्रा है धारावाहिक dilutions के लिए लिया विभाज्य की मात्रा है, जहां – कुल CFU के रूप में (मनाया CFU) × (कमजोर पड़ने कारक) × (वी वी) का अनुमान है. इसी समय, बरामद कोशिकाओं के शेष 100 माइक्रोग्राम / एमएल कार्बेनिसिलिन साथ पूरक 200 मिलीलीटर लेग टीका लगाना करने के लिए उपयोग. एक प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर में रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं के विकास और तब मानक प्रक्रियाओं का पालन प्लास्मिड डीएनए को अलग. 2 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर SfiI साथ अलग प्लाज्मिड पुस्तकालय के एक विभाज्य पचाने और सम्मिलित की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए एक 1% agarose जेल पर चलाते हैं. सी द्वारा प्लाज्मिड पुस्तकालय linearizeKpnI और XbaI का उपयोग प्रमोटर वेरिएंट और टैग के बीच utting. पाचन क्षमता को अधिकतम करने के लिए, धारावाहिक digestions प्रदर्शन: सबसे पहले, 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर KpnI साथ पचाने और चुंबकीय मोती का उपयोग कर शुद्ध. दूसरा, 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 यू चिंराट alkaline फॉस्फेट के अलावा के साथ XbaI साथ पचा, गर्मी 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय, और फिर चुंबकीय मोती का उपयोग कर शुद्ध. पूरी linearization को सत्यापित करने के लिए एक 1% agarose जेल पर एक विभाज्य चलाएँ. काटा हुआ प्लाज्मिड दिख रहा है, तो linearized टुकड़ा जेल शुद्ध होना चाहिए. स्तनधारी कोशिकाओं में अभिकर्मक के लिए उपयुक्त एक एम पी आर ए पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए, linearized मध्यवर्ती पुस्तकालय में KpnI / XbaI संगत सिरों के साथ एक ओआरएफ ligate. PMPRAdonor1 से एक संगत luc2 ओआरएफ टुकड़ा तैयार करने के लिए, 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर KpnI और XbaI साथ इस प्लाज्मिड को पचाने और एक 1% agarose जेल पर चलाते हैं. ओआरएफ टुकड़ा उत्पाद शुल्क (1.7 कश्मीरइस मामले में बी) और एक जेल शुद्धि स्पिन स्तंभ का उपयोग कर शुद्ध. कदम 2.3-2.8 में वर्णित के रूप में linearized मध्यवर्ती पुस्तकालय में ओआरएफ टुकड़ा क्लोन. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर KpnI साथ एम पी आर ए पुस्तकालय का (1-2 ग्राम के लिए इसी) एक विभाज्य डाइजेस्ट और एक 1% agarose जेल पर चलाते हैं. पच पुस्तकालय एक एकल बैंड के रूप में चलाता है तो अतिरिक्त बैंड (आमतौर पर मध्यवर्ती निर्माणों का भार के लिए इसी), पुस्तकालय निम्नानुसार आगे शुद्ध किया जा सकता मनाया जाता है, तो धारा 3 के लिए आगे बढ़ें: 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर KpnI साथ दूषित पुस्तकालय की 3-5 ग्राम पचाने और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात एक 0.8% agarose जेल पर चलाते हैं. , सही पुस्तकालय बैंड आबकारी एक जेल शुद्धि स्पिन स्तंभ का उपयोग डीएनए शुद्ध और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर उच्च एकाग्रता टी -4 डीएनए ligase का उपयोग कर स्वयं बंधाव प्रदर्शन करते हैं. कदम 2.8 में वर्णित के रूप में तो परिवर्तन और अंतिम पुस्तकालय डीएनए अलगाव दोहराएँ. 3 टीransfection, Perturbation, और शाही सेना अलगाव प्रत्येक स्वतंत्र अभिकर्मक, संस्कृति उपयुक्त माध्यम में कोशिकाओं की संख्या (एम पी आर ए पुस्तकालय जटिलता द्वारा निर्धारित रूप में, चर्चा देखें). उदाहरण के लिए, DMEM में संस्कृति HEK293T / 17 कोशिकाओं 10% FBS और एल glutamine / पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक. प्रत्येक पुस्तकालय और प्रयोगात्मक हालत के लिए कम से कम दो स्वतंत्र transfections के लिए संस्कृति कोशिकाओं. एम पी आर ए plasmids के साथ संवर्धित कोशिकाओं Transfect. अभिकर्मक विधि और कानून प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. प्रत्येक ट्रांसफ़ेक्ट नमूने के लिए, एक मिलान नियंत्रण के रूप में प्लास्मिड डीएनए के एक विभाज्य (50-100 एनजी) बरकरार रहती है. उदाहरण के लिए, 0.5 10 x 7 HEK293T / उगाई 17 कोशिकाओं transfect करने ~ मैं 30 μl Lipofectamine LTX और 10 μl प्लस अभिकर्मक का उपयोग सीरम मध्यम से कम 1 मिलीलीटर Opti- सदस्य में 10 माइक्रोग्राम प्लाज्मिड डीएनए के साथ एक 10 सेमी संस्कृति डिश में 50% संगम. 5 घंटे के बाद अभिकर्मक मिश्रण निकालें और अनुमतिकोशिकाओं 24-48 घंटे के लिए ठीक करने के लिए. वैकल्पिक रूप से, डिजाइन लाइब्रेरी में context- या संकेत निर्भर विनियामक दृश्यों को सक्रिय करने के लिए आवश्यक किसी भी गड़बड़ी करते हैं. कोशिकाओं फसल और उनके निर्माता के निर्देशों का उपयोग कर मानक oligo (डीटी) सेलूलोज कॉलम या मोतियों का उपयोग पाली (ए) + mRNA अलग. कॉलम या मोतियों की अधिकतम बाध्यकारी क्षमता काटा कोशिकाओं से उम्मीद mRNA की कुल राशि से अधिक है कि यह सुनिश्चित करें. उदाहरण के लिए, धारा 3.3 से उम्मीद की उपज लगभग 0.5-2.5 माइक्रोग्राम mRNA है. 4 टैग Seq ट्रांसफ़ेक्ट सेल lysates से वेक्टर डीएनए का भार को समाप्त करने के लिए, पर 2.4 μl टर्बो DNase निष्क्रियता अभिकर्मक, 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 μl टर्बो DNase (2 यू) और 2.3 μl 10x टर्बो DNase बफर के साथ प्रत्येक 20 μl mRNA नमूना इलाज जोड़ना आरटी तो 5 मिश्रण के साथ मिनट, 90 सेकंड के लिए 10,000 जी पर अपकेंद्रित्र, और के लिए एक ताजा ट्यूब का हल हस्तांतरण. सत्यापित करें एक agarose जेल पर उत्पादों प्रत्येक mRNA नमूना के 60-100 एनजी पर खंड 4.6 में वर्णित के रूप में पीसीआर प्रदर्शन, और फिर चलाकर पवित्रता. (Luc2 साथ pMPRA1 का उपयोग अगर 0.25 KB) विशिष्ट amplicons दिखाई दे रहे हैं, तो स्तंभ इलाज mRNA को शुद्ध और फिर DNase उपचार दोहराएँ. , टैग Seq अनुक्रमण पुस्तकालयों उत्पन्न सीडीएनए को संवाददाता mRNA बदलने और पीसीआर द्वारा अनुक्रमण एडेप्टर जोड़ने के लिए. तालिका 3 में वर्णित के रूप में mRNA / आरटी प्राइमर मिश्रण सेट करें. तो बर्फ पर जगह, 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. तालिका 4 में वर्णित के रूप में समानांतर में, सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रियाओं की स्थापना की. अभिकर्मक 1x मात्रा (μl) mRNA नमूना (400-700 एनजी कुल) 8 Oligo-0dT (50 माइक्रोन) 1 dNTP (10 मिमी प्रत्येक) 1 सीडीएनए संश्लेषण के लिए ove_content "> 3 तालिका आरएनए / रिवर्स प्रतिलेखन प्राइमर मिश्रण. अभिकर्मक 1x मात्रा (μl) 10x सुपरस्क्रिप्ट III आरटी बफर 2 2 MgCl (25 मिमी) 4 डीटीटी (0.1 एम) 2 RNaseOut (40 यू / μl) 1 सुपरस्क्रिप्ट III (200 यू / μl) 1 तालिका 4 सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया मिश्रण. धीरे mRNA / आरटी प्राइमर सीडीएनए संश्लेषण घोला जा सकता है के साथ घोला जा सकता है गठबंधन. 50 मिनट, 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और फिर बर्फ पर जगह है. अंत में, 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 यू Ribonuclease के एच साथ सेते हैं. 4-6 μl के साथ तालिका 5 में वर्णित के रूप में पीसीआर प्रतिक्रियाओं सेट अपसीडीएनए प्रतिक्रिया मिश्रण या टेम्पलेट्स के रूप में 50 एनजी संवाददाता प्लाज्मिड. फिर पीसीआर प्रवर्धन (2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 26 एक्स [30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 30 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 72 डिग्री सेल्सियस], 3 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस) प्रदर्शन करते हैं. अभिकर्मक 1x मात्रा (μl) 2x PfuUltra द्वितीय HotStart पीसीआर मास्टर मिक्स 25 प्राइमर TagSeq_P1 (25 माइक्रोन) 0.5 प्राइमर TagSeq_P2 (25 माइक्रोन) 0.5 टेम्पलेट (mRNA, सीडीएनए मिश्रण या प्लास्मिड डीएनए) बदलता है Nuclease मुक्त पानी 50 को सारणी 5 टैग Seq पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण. एक 2% agarose जेल के माध्यम से पीसीआर उत्पादों भागो, टैग Seq पुस्तकालय amplicons को इसी आबकारी बैंड (0.25 केबी का उपयोग अगरluc2 साथ pMPRA1) और इन का उपयोग कर जेल शुद्धि स्पिन कॉलम शुद्ध. पूल, denature और एक Illumina अनुक्रमण साधन के साथ सीधे शुद्ध टैग Seq amplicons अनुक्रम. फ़िल्टर कम गुणवत्ता अनुक्रम टैग के भीतर कम से कम 30 के स्कोर या बी) वास्तव में एक तरह से डिजाइन टैग मेल नहीं खाता एक Phred गुणवत्ता के साथ एक या एक से अधिक स्थिति में होते हैं) है कि सभी एक को निकाल कर पढ़ता है. प्रत्येक शेष टैग प्रत्येक पुस्तकालय में प्रकट होता है बार की संख्या गिनती. TPM के लिए (मिलियन अनुक्रम टैग प्रति टैग) टैग मायने रखता मानक के अनुसार और फिर अनुक्रमण पुस्तकालयों के प्रत्येक जोड़ी के लिए प्लाज्मिड व्युत्पन्न टैग की गिनती के अधिक mRNA व्युत्पन्न टैग की गिनती के अनुपात की गणना. कई अलग टैग प्रत्येक अनुक्रम संस्करण से जुड़े थे, तो नीचे की ओर विश्लेषण के लिए उनके बीच का अनुपात का उपयोग करें.

Representative Results

एम पी आर ए उच्च संकल्प, विनियामक तत्वों का अनुक्रम गतिविधि रिश्तों की मात्रात्मक विच्छेदन की सुविधा. एक सफल एम पी आर ए प्रयोग आम तौर पर ट्रांसफ़ेक्ट पुस्तकालय (चित्रा 3 ए) में दृश्यों के बहुमत के लिए अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माप निकलेगा. गरीब reproducibility (3B चित्रा) मनाया जाता है, इस कारण assayed दृश्यों के बीच 1) कम निरपेक्ष गतिविधि, या 2) कम अभिकर्मक दक्षता या तो बरामद शाही सेना के नमूने में संवाददाता mRNAs की एक बहुत कम एकाग्रता का संकेत है. चित्रा 4 परख करने की क्रिया द्वारा उत्पन्न एक प्रतिनिधि "जानकारी पदचिह्न" 1,2 दिखाता ~ साथ या सेंडाइ वायरस के लिए जोखिम के बिना HEK293 कोशिकाओं में मानव IFNB जीन की नदी के ऊपर एक 145 बीपी अनुक्रम के 37,000 यादृच्छिक वेरिएंट. प्रमोटर टाटा बॉक्स और ज्ञात समीपस्थ बढ़ाने 10 स्पष्ट रूप से जानकारी युक्त regi के रूप में पहचाना जा सकता हैएक वायरस पर निर्भर ढंग से ons. चित्रा 3 टैग Seq reproducibility. उच्च (ए) और कम (बी) के reproducibility के साथ दो स्वतंत्र दोहराने transfections से टैग Seq डेटा के उदाहरण दिखा तितर बितर भूखंडों. उत्तरार्द्ध भूखंड दो प्रतिकृति का केवल एक में उच्च mRNA की गिनती के साथ कई ग़ैर टैग से पता चलता है. इस तरह की कलाकृतियों आमतौर पर रिपोर्टर mRNAs की सांद्रता के कारण रिपोर्टर निर्माणों के बीच कम निरपेक्ष गतिविधियों, या कम अभिकर्मक क्षमता के लिए, या तो मात्रात्मक पीसीआर प्रवर्धन के लिए बहुत कम थे कि संकेत मिलता है. मानव IFNB प्रतिलेखन शुरू साइट और समीपस्थ बढ़ाने की 4 चित्र सूचना Footprinting से. </strओंग> नदी के ऊपर मानव IFNB जीन की एक 145 न्यूक्लियोटाइड (एनटी) क्षेत्र के लगभग 37,000 यादृच्छिक वेरिएंट (ए) के साथ और सेंडाइ वायरस (B) जोखिम के बिना HEK293 कोशिकाओं में एम पी आर ए का उपयोग assayed गया. नीले सलाखों प्रत्येक स्थिति में संवाददाता उत्पादन और न्यूक्लियोटाइड के बीच आपसी जानकारी दिखा. समीपस्थ बढ़ाने और टाटा बॉक्स वायरल संक्रमण पर उच्च जानकारी सामग्री के क्षेत्रों के रूप में बाहर खड़े हो जाओ.

Discussion

MPRA is a flexible and powerful tool for dissection of sequence-activity relationships in gene regulatory elements. The success of MPRA experiments depend on at least three factors: 1) careful design of the sequence library, 2) minimization of artifacts during amplification and cloning, and 3) high transfection efficiency.

The possible lengths of the variable regions in the reporter constructs are largely determined by the synthesis or cloning technology used. Standard OLS is generally limited to about 200 nt, but this protocol is compatible with inserts up to at least 1,000 nt. Note that variable regions that are highly repetitive or contain strong secondary structures may end up underrepresented due to PCR and cloning biases. The length of the tags that identify each of the variable regions should be 10-20 nt and the collection of tags should ideally be designed such there are at least two nucleotide differences between any pair. Tags that contain the seed sequences of known microRNA or other factors that might influence mRNA stability should also be avoided when possible.

A key parameter in the design of MPRA experiments is the total number of distinct reporter constructs to be included in the library (the design complexity, denoted C_D). In practice, C_D is limited by the number of cultured cells that can be transfected. As a rule of thumb, the total number of transfected cells should be at least 50-100 times greater than C_D. For example, if 20 million cells can be transfected with a transfection efficiency of 50%, then C_D should be no more than ~200,000. Note that C_D is equal to the number of distinct regulatory sequence variants multiplied by the number of distinct tags per sequence. The more distinct tags are linked to each regulatory sequence, the more accurate the estimate of the activity of that sequence can be made (because measurements from distinct tags can be averaged), but the fewer distinct variants can be assayed in one experiment. The optimal choice depends on the experimental design. In a simple “promoter bashing” experiment, where a mathematical model will be fitted to the aggregated measurements, a single tag per variant is usually sufficient. In a screen for single-nucleotide polymorphisms that cause changes in regulatory activities, it may be necessary to use 20 or more tags per allele to obtain statistically robust results, because comparing each pair of alleles requires a separate hypothesis test.

If the sequences to be assayed are not expected to contain transcription start sites, a constant promoter can also be added in the same fragment. For example, pMPRAdonor2 (Addgene ID 49353) includes a minimal TATA-box promoter that is useful when the upstream variable region is expected to have significant enhancer activity, while pMPRAdonor3 (Addgene ID 49354) includes a modified, strong SV40 viral promoter that is useful when the variable region is expected to contain silencer activity or other negative regulatory elements.

Raw OLS products often contain a significant fraction of truncated oligonucleotides. These may interfere with accurate PCR amplification of the designed sequences, particularly when there is significant homology between them. Using PAGE purification to remove truncated synthesis products and emulsion PCR to minimize amplification artifacts are effective techniques for ensuring high library quality. If either step is impractical, it is imperative to minimize the number of PCR cycles used at each amplification step. Selection and expansion of the cloned library in liquid culture is generally sufficient to maintain the design complexity, but if recombination-prone vectors are to be used or significant representation bias is observed, the recovered cells can instead be plated directly onto large LB agar plates, expanded as individual colonies and then scraped off for DNA isolation. It is also important to consider the potential impact of synthesis errors, which are typically found at a rate of 1:100-500 in OLS. Full-length sequencing of the reporter constructs prior to transfection is recommended to identify and correct for such errors.

It is not necessary to introduce reporter constructs into every cell in the transfected culture, but transfection efficiencies below ~50% may lead to poor signal to noise ratios. It is advisable to optimize transfection conditions prior to performing MPRA experiments in a new cell type. When working with hard-to-transfect cell types, MPRA signals can be boosted by pre-selecting transfected cells. The pMPRA vector series includes variants that constitutively express a truncated cell surface marker that can be used to physically enrich for transfected cells prior to RNA isolation (for example, Addgene IDs 49350 and 49351).

Materials

Oligonucleotide library synthesis	Agilent, CustomArray or other OLS vendors	custom	If using OLS construction method
pMPRA1	Addgene	49349	MPRA plasmid backbone
pMPRAdonor1	Addgene	49352	luc2 ORF donor plasmid
TE 0.1 Buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)	Generic	n/a	OLS buffer
Novex TBE-Urea Gels, 10%	Life Technologies	EC6875BOX	PAGE purification of OLS products
Novex TBA-Urea Sample Buffer	Life Technologies	LC6876	PAGE purification of OLS products
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies	S-11494	PAGE purification of OLS products
Micellula DNA Emulsion & Purification Kit	EURx/CHIMERx	3600-01	Library amplification by emulsion PCR
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent	600675	Polymerase for emulsion PCR
SfiI	New England Biolabs	R0123S	Library cloning with pMPRA vectors
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S	Library cloning with pMPRA vectors
XbaI	New England Biolabs	R0145S	Library cloning with pMPRA vectors
T4 DNA Ligase (2,000,000 units/ml)	New England Biolabs	M0202T	Library cloning with pMPRA vectors
One Shot TOP10 Electrocomp E. coli	Life Technologies	C4040-50	Library cloning with pMPRA vectors
LB agar and liquid media with carbenicllin	Generic	n/a	Growth media for cloning
E-Gel EX Gels 1%	Life Technologies	G4010-01	Library verification and purification
E-Gel EX Gels, 2%	Life Technologies	G4010-02	Library verification and purification
MinElute Gel Extraction Kit	Qiagen	28604	Library and backbone purification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Library DNA isolation
Cell culture media	n/a	n/a	Experiment-specific
Transfection reagents	n/a	n/a	Experiment-specific
MicroPoly(A)Purist Kit	Life Technologies	AM1919	mRNA isolation
TURBO DNA-free Kit	Life Technologies	AM1907	Plasmid DNA removal
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Life Technologies	18080-051	cDNA synthesis
PfuUltra II Hotstart PCR Master Mix	Agilent	600850	Polymerase for Tag-Seq PCR
Primers (see text)	IDT	custom	PAGE purify Tag-Seq primers