Geração e Purificação de INO80 cromatina remodelação Complexos Humanos e subcomplexos

Summary

Este protocolo descreve um procedimento para gerar e purificação de tipo selvagem e as versões mutantes do complexo remodelação INO80 cromatina humana. Marcada com epitopo versões de subunidades INO80 são estavelmente expressos em células HEK293, e complexos completos e complexos que faltam conjuntos específicos de subunidades são purificados por cromatografia de imunoafinidade.

Abstract

INO80 complexos de remodelação da cromatina regular a dinâmica nucleossomos e acessibilidade DNA, catalisando ATP-dependente remodelação nucleosome. Complexos INO80 humanos consistem de 14 subunidades de proteína incluindo INO80, um SnF2-como ATPase, que serve tanto como a subunidade catalítica e a armação para a montagem dos complexos. Funções das outras subunidades e os mecanismos pelos quais eles contribuem para a remodelação da cromatina actividade do complexo INO80 permanecem pouco compreendidos, em parte devido à dificuldade de gerar subconjuntos INO80 em células humanas ou de sistemas de expressão heterólogos. Este protocolo JOVE descreve um processo que permite a purificação de subcomplexos INO80 remodelação da cromatina humanos que carecem de uma subunidade ou um subconjunto de subunidades. FLAG no terminal-N marcada com epitopo INO80 cDNA são estavelmente introduzido no rim embrionário humano (HEK) 293 linhas de células que utilizam recombinação mediada por Flp. No caso em que um subconjunto de subunidades do complexo INO80 é abe excluídos, uma vez expressa proteínas INO80 mutantes que não possuem a plataforma necessária para a montagem dessas subunidades. No caso de um indivíduo é a subunidade a ser esvaziada, uma transfects siRNAs voltadas para esta subunidade em uma linha de células HEK 293 que expressam estavelmente FLAG etiquetado INO80 ATPase. Extratos nucleares são preparados, e imunoprecipitação FLAG é realizada para enriquecer frações de proteínas contendo derivados INO80. As composições de subcomplexos INO80 purificadas podem então ser analisados ​​por meio de métodos tais como imunoblot, coloração com prata, e espectrometria de massa. Os INO80 e INO80 subcomplexos gerados de acordo com este protocolo pode ser ainda analisada utilizando vários ensaios bioquímicos, que são descritos no protocolo JOVE acompanha. Os métodos aqui descritos podem ser adaptados para o estudo das propriedades estruturais e funcionais de qualquer mamífero de subunidades múltiplas de remodelação da cromatina e de complexos de modificadores.

Introduction

Família SnF2 complexos de remodelação da cromatina evolutivamente conservadas são reguladores chave da organização da cromatina e acessibilidade DNA ^1. Estes complexos de remodelação sempre incluir uma subunidade ATPase centro SnF2 semelhante, o qual, em alguns casos, monta com várias proteínas acessórias e forma de multi-subunidades macro-molecular conjuntos. Para estudar os detalhes moleculares do processo de remodelação da cromatina dependentes de ATP, é importante compreender as contribuições de determinados subconjuntos de subunidades e / ou estruturas de domínio para as atividades dos complexos. Tais análises exigem a capacidade de gerar complexos mu....

Protocol

1 Geração e Cultura de HEK293 Lines Estável célula que expressa Corpo Inteiro ou versões mutantes FLAG marcadas com epítopos INO80 ou outras subunidades INO80 complexos

1. O clone de cDNA que codifica para o comprimento completo ou mutante humano INO80 ATPase ou outra subunidade INO80 no vector de expressão de mamífero pcDNA5 / FRT com um, o terminal N epitopo marcador FLAG em grelha.
2. Confirme a sequência dos cDNAs inseridos por sequenciamento de DNA antes de prosseguir.
3. Para realizar a transfecção, crescer Flp-Em células HEK293 10 centímetros em pratos de cultura de tecidos em meio contendo DMEM (Dulbecco Modified Eagle Médium), 5% de glu....

Results

A Figura 1 mostra um fluxograma que resume os procedimentos usados ​​para gerar, purificar e caracterizar INO80 dependentes de ATP complexos de remodelação da cromatina humanos.

Como ilustrado nas Figuras 2 e 3, estes procedimentos permitem a geração de ambos os tipo INO80 e INO80 subcomplexos selvagens que faltam várias subunidades, permitindo assim análises bioquímicas subsequentes da contribuição destas subunidades que faltam para ativida.......

Discussion

Estudos estruturais e funcionais de várias subunidades complexos mamíferos remodelação da cromatina de eucariotos superiores foram prejudicados pela dificuldade de preparar bioquimicamente quantidades úteis de tais complexos contendo subunidades mutantes ou falta certas subunidades completamente. Há um certo número de dificuldades técnicas: Em primeiro lugar, a manipulação genética em células de mamíferos tem sido tecnicamente difícil e demorado. Ao contrário das células de levedura, cujo genoma pode ser facilmente edit.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Cellgro	10-013-CV
Glutamax-I (glutamina estabilizada)	Life Technologies	35050-079
Soro bovino fetal	SAFC	12176C
FuGENE6 reagente de transfecção	Promega	E2312
Higromicina B, estéril em PBS	AG Scientific	H-1012-PBS
vetor pcDNA5/FRT	Life Technologies	V6010-20
Flp-In células HEK293	Life Technologies	R780-07
pOG44 Flp-Recombinase Expression	Life Technologies	V600520
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	F2426
soro de bezerro	SAFC	12138C
TARGETplus Piscina SMARTsiRNA	Dharmacon / Thermo Scientific	vários
5x tampão de ressuspensão de siRNA	Dharmacon / Thermo Scientific	#B-002000-UB-100
Lipofectamine RNAiMAX	Life Technologies	13778
Opti-MEM Soro Reduzido Medium	Life Technologies	51985-091
PBS	Cellgro	45000	VWR
TrypLE (tripsina)	Life Technologies	12604
1x FLAG Peptídeo	Sigma	F3290
Micro Bio-Spin Coluna de Cromatografia	Bio-Rad	737-5021
Dispositivo de Filtro Ultra Centrífugo Amicon (50k MWCO)	Amicon	UFC805024	Fisher Scientific
Zeba Colunas de Dessalinização	Thermo Scientific	89882
Anticorpo Anti-FLAG M2, camundongo	Sigma	F3165
Anti-FLAG M2 anticorpo, coelho	Sigma	F7425
Inibidor de Protease Coquetel	Sigma	P8340
benzonase	Novagen	70664
Equipamento
JS-4.2 rotor em uma centrífuga J6	Beckman-Coulter	339080
JA-17 rotor	Beckman-Coulter	369691
tubos de policarbonato de 10 ml	Beckman-Coulter	355630
Frascos de policarbonato de 70 ml	Beckman-Coulter	355655
Rotor de Ti Tipo 45	Beckman-Coulter	339160
Tipo 70.1 Ti rotor	Beckman-Coulter	342184
BD Clay Adams Nutator Mixer	BD Diagnostics	15172-203	VWR
Glas-Col Tubo/Frasco Rotador	Glas-Col	099A RD4512
PCR termociclador PTC 200	MJ Research	PTC 200
incubadora de garrafas de rolo	Bellco biotecnologia	353348
Membrana de transferência Immobilon-FL 7 x 8,4	Millipore	IPFL07810
tubos de microcentrífuga	lubrificados de 1,5 mlCostar	3207