Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.
Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.
وتشمل المجمعات SNF2 الكروماتين الأسرة على إعادة عرض مثل SNF2 المركزية أتباز فرعية 1،2. ATPases بعض الوظائف مثل SNF2 كإنزيمات فرعية واحدة، في حين يعمل آخرون مثل الوحيدات الحفاز من أكبر المجمعات متعددة فرعية. توضيح الآليات الجزيئية التي فيها كل من مفارز الكروماتين تساهم المجمعات إعادة عرض لأنشطتها يتطلب القدرة على أداء فحوصات البيوكيميائية التي تشريح عملية التجديد.
إعادة عرض النيوكليوسومات ATP التي تعتمد من قبل مجمع INO80 البشري وغيرها من لونين إعادة عرض الانزيمات يمكن تصوره على أنه عملية متعددة الخطوات التي تبدأ مع ملزمة للانزيم إعادة عرض لnucleosomes، تليها تفعيل DNA- و / أو النيوكليوسومات التي تعتمد أتباز، إزفاء للانزيم إعادة عرض على الحمض النووي nucleosomal، وإعادة تموضع في نهاية المطاف nucleosomes 1،2. فهم التفاصيل الجزيئية لعملية إعادة عرض الكروماتين ص تعتمد على ATPequires تشريح للتفاعل إعادة عرض في خطواتها الفردية وتعريف بمساهمات مفارز الفردية للمجمع لونين إعادة عرض لكل خطوة من خطوات التفاعل. مثل هذه التحليلات تتطلب القدرة على تحليل إعادة النيوكليوسومات وغيرها من الأنشطة باستخدام ركائز الجزيئية المحددة في المختبر.
في البروتوكول إن الرب السابق، وصفنا الإجراءات المستخدمة لتوليد INO80 المجمعات إعادة عرض الكروماتين وsubcomplexes مع مكونات فرعية محددة 3. هنا، نقدم ثلاثة فحوصات البيوكيميائية التي تمكن التحليل الكمي للالنيوكليوسومات ملزمة، DNA- والنيوكليوسومات تنشيط أتباز، وأنشطة إعادة النيوكليوسومات المرتبطة بهذه المجمعات.
لضمان إعادة النيوكليوسومات والأنشطة أتباز نلاحظ في المقايسات تعتمد على النشاط التحفيزي المجمعات INO80، وليس على إعادة تلويث و / أو الأنزيمات أتباز، فإننا النيوكليوسومات الفحص بشكل روتيني ويعيد النشاط أتباز من الإصدارات نشطة حفاز المجمعات INO80، طهروا في بالتوازي مع ال?…
The authors have nothing to disclose.
Work in the authors’ laboratory is supported by a grant from the National Institute of General Medical Sciences (GM41628) and by a grant to the Stowers Institute for Medical Research from the Helen Nelson Medical Research Fund at the Greater Kansas City Community Foundation.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
10x PCR reaction buffer | Roche Applied Science | 11435094001 | |
Roche Taq DNA Polymerase | Roche Applied Science | 11435094001 | |
NucAway Nuclease-free Spin Columns | Ambion | Cat. # AM10070 | |
ultrapure ATP | USB/Affymetrix | 77241 25 UM | |
bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
N,N,N´,N´-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Thermo Scientific | 17919 | Fisher Scientific |
40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Amresco | 0254-500ML | |
Sonicated salmon sperm DNAs | GE Healthcare | 27-4565-01 | |
10% ammonium persulfate (APS) | Thermo Scientific | 17874 | |
benzonase | Novagen | Cat. No. 70664 | |
[α-32P] ATP (3000 Ci/mmol) | PerkinElmer | BLU003H250UC | |
dCTP, [α-32P]- 6000Ci/mmol | PerkinElmer | BLU013Z250UC | |
Equipment | Company | ||
PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
Hoefer vertical electrophoresis unit | Hoefer | SE600X-15-1.5 | |
lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 | |
Storage Phosphor Screen | Molecular Dynamics | 63-0034-79 | |
3MM filter paper | Whatman | 28458-005 | VWR |
Typhoon PhosphorImager | GE Healthcare | 8600 | |
ImageQuant software | GE Healthcare | ver2003.02 | |
TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F | Millipore | 5725-7 | |
Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe | Biodex | Model 14C |