Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.
Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.
SNF2 семья хроматина комплексы включают центральную SNF2-как АТФазную субъединицы 1,2. Некоторые SnF2-АТФазы, как функция в виде отдельных субъединиц ферментов, в то время как другие функционировать в качестве каталитической субъединицы крупных мульти-субъединицы комплексов. Выяснение молекулярных механизмов, с помощью которых каждый из субъединиц хроматина комплексов способствовать их деятельности требует способность выполнять биохимические анализы, которые рассекают процесс ремоделирования.
АТФ-зависимой нуклеосом ремоделирование человеческим INO80 комплекса и других ферментов хроматина могут быть предусмотрены как многоступенчатый процесс, который начинается с связывания фермента ремоделирования к нуклеосом, с последующей активацией его ДНК-и / или нуклеосом-зависимой АТФ-азы, транслокация ремоделирования фермента на нуклеосомной ДНК, и в конечном итоге репозиционирования нуклеосом 1,2. Понимание молекулярных детали АТФ-зависимый процесс ремоделирования хроматина гequires рассечение реакции ремоделирования в его отдельных этапов и определения вклада отдельных субъединиц хроматина комплекса к каждому стадии реакции. Такие анализы требуют умение анализировать нуклеосом ремоделирования и другие мероприятия с использованием определенных молекулярных субстратов в пробирке.
В предыдущем протоколе богу, мы описали процедуры, используемые для создания INO80 хроматина комплексов и подкомплекса с определенными субъединиц композиций 3. Здесь мы представляем три биохимические анализы, которые позволяют количественный анализ нуклеосоме связывания, ДНК-и нуклеосом-активируется АТФ-азы, и нуклеосом деятельности ремоделирования связанных с такими комплексами.
Чтобы гарантировать, что нуклеосом ремоделирование и деятельность АТФазы мы наблюдаем в анализах зависит от каталитической активности INO80 комплексов, а не на загрязнение ремоделирования и / или ферменты, АТФазы, мы обычно анализ нуклеосом реконструкции и АТФазы каталитически неактив?…
The authors have nothing to disclose.
Work in the authors’ laboratory is supported by a grant from the National Institute of General Medical Sciences (GM41628) and by a grant to the Stowers Institute for Medical Research from the Helen Nelson Medical Research Fund at the Greater Kansas City Community Foundation.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
10x PCR reaction buffer | Roche Applied Science | 11435094001 | |
Roche Taq DNA Polymerase | Roche Applied Science | 11435094001 | |
NucAway Nuclease-free Spin Columns | Ambion | Cat. # AM10070 | |
ultrapure ATP | USB/Affymetrix | 77241 25 UM | |
bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
N,N,N´,N´-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Thermo Scientific | 17919 | Fisher Scientific |
40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Amresco | 0254-500ML | |
Sonicated salmon sperm DNAs | GE Healthcare | 27-4565-01 | |
10% ammonium persulfate (APS) | Thermo Scientific | 17874 | |
benzonase | Novagen | Cat. No. 70664 | |
[α-32P] ATP (3000 Ci/mmol) | PerkinElmer | BLU003H250UC | |
dCTP, [α-32P]- 6000Ci/mmol | PerkinElmer | BLU013Z250UC | |
Equipment | Company | ||
PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
Hoefer vertical electrophoresis unit | Hoefer | SE600X-15-1.5 | |
lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 | |
Storage Phosphor Screen | Molecular Dynamics | 63-0034-79 | |
3MM filter paper | Whatman | 28458-005 | VWR |
Typhoon PhosphorImager | GE Healthcare | 8600 | |
ImageQuant software | GE Healthcare | ver2003.02 | |
TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F | Millipore | 5725-7 | |
Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe | Biodex | Model 14C |