Os ensaios bioquímicos para analisar as actividades de ATP-dependente cromatina remodelação Enzimas

Resumo

Aqui descrevemos ensaios bioquímicos que podem ser usados para caracterizar enzimas de remodelação da cromatina dependentes de ATP por suas habilidades de 1) catalisar o deslizamento do nucleossomo dependente de ATP, 2) envolver-se com substratos de nucleossomos e 3) hidrolisar ATP de maneira dependente de nucleossomo ou DNA.

Resumo

Membros da família SNF2 de ATPases geralmente funcionam como componentes de complexos de remodelação de cromatina de múltiplas subunidades que regulam a dinâmica do nucleossomo e a acessibilidade do DNA, catalisando a remodelação do nucleossomo dependente de ATP. Dissecar bioquimicamente as contribuições de subunidades individuais de tais complexos para a reação de remodelação da cromatina dependente de ATP em várias etapas requer o uso de ensaios que monitoram a produção de produtos de reação e medem a formação de intermediários de reação. Este protocolo JOVE descreve ensaios que permitem medir as atividades bioquímicas de complexos de remodelação da cromatina ou subcomplexos contendo várias combinações de subunidades. A remodelação da cromatina é medida usando um ensaio deslizante de nucleossomo dependente de ATP, que monitora o movimento de um nucleossomo em uma molécula de DNA usando um método baseado em ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA). A atividade de ligação ao nucleossomo é medida monitorando a formação de mononucleossomos ligados a complexos de remodelação usando um método semelhante baseado em EMSA, e a atividade de ATPase dependente de DNA ou nucleossomo é testada usando cromatografia em camada fina (TLC) para medir a taxa de conversão de ATP em ADP e fosfato na presença de DNA ou nucleossomos. Usando esses ensaios, pode-se examinar as funções das subunidades de um complexo de remodelação da cromatina comparando as atividades do complexo completo com aquelas que não possuem uma ou mais subunidades. O complexo de remodelação da cromatina INO80 humano é usado como exemplo; no entanto, os métodos descritos aqui podem ser adaptados ao estudo de outros complexos de remodelação da cromatina.

Introdução

SnF2 complexos de remodelação da cromatina família incluem um SnF2-como centro ATPase subunidade ^1,2. Alguns ATPases função SnF2-como enzimas individuais de subunidade, enquanto que outros funcionam como a subunidade catalítica de grandes complexos de multi-subunidades. Elucidar os mecanismos moleculares pelos quais cada uma das subunidades da cromatina complexos de remodelação contribuir para as suas actividades requer a capacidade de realizar ensaios bioquímicos que dissecam o processo de remodelação.

ATP-dependente remodelação nucleossoma pelo complexo INO80 humano e outras enzimas remodelação da cromatina pode ser concebido....

Protocolo

1. ATP-dependentes nucleossoma Remodelação Ensaios

Para medir as actividades de ATP-dependente nucleossoma remodelação, imunopurificada INO80 ou subcomplexos INO80 são incubados com ATP e um substrato mononucleosomal, que contém um único nucleossoma posicionado numa extremidade de um fragmento de ADN de 216 pb, ³² P-marcado. Os produtos da reacção são então sujeitos a electroforese em géis de poli-acrilamida nativo.

1. Para gerar o, '601' fragmento de ADN marcado com ³² P, a partir de amplificar ^pGEM-3Z-4 601 um fragmento de ADN de 216 pb que contém uma sequência de 601 posicionamento nucle....

Resultados

As figuras mostram os resultados representativos de testes bioquímicos usados ​​para caracterizar as actividades, incluindo INO80 nucleossoma deslizante (Figura 1) e de ligação (Figura 2) e DNA- ensaios ou ensaios de ATPase dependente de nucleossoma (Figura 3).

A experiência apresentada na Figura 1 compara a capacidade dos complexos INO80 intactas purificado através de FLAG-Ies2 ou FLAG-INO80E e de INO80 subcomplexos purific.......

Discussão

Para garantir que a remodelação nucleosome e atividades ATPase observamos em ensaios dependem da atividade catalítica de complexos INO80, e não sobre a contaminação de remodelação e / ou enzimas ATPase, nós nucleosome rotineiramente ensaio remodelação e atividade ATPase de versões cataliticamente inativos de complexos INO80, purificado em paralelo com o tipo selvagem INO80 utilizando o mesmo procedimento. Uma reacção de controlo negativo a que falta o ATP também deve ser realizada quando se examina a actividade de remod.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Inibidor de Protease Coquetel	Sigma	P8340
10x PCR reage buffer	Roche Ciência Aplicada
Roche Taq DNA Polimerase	Roche Applied Science
Colunas de Spin Nuclease NucAway sem Nuclease	Ambion	Cat. # AM10070
ATP ultrapuro	USB/Affymetrix	77241 25 UM
albumina de soro bovino	Sigma	A9418
40% Acrilamida/Bis 37.5:1	Amresco	0254-500ML
DNAs de esperma de salmão sonica	GE Healthcare	27-4565-01
10% persulfato de amônio (APS)	Thermo Scientific	17874
benzonase	Novagen	Cat. No. 70664
dCTP, [α-32P]- 6.000 Ci/mmol	Termociclador PerkinElmer	BLU013Z250UC
PCR PTC 200	MJ Research	PTC 200
Unidade de eletroforese vertical Hoefer		SE600X-15-1.5
tubos de microcentrífuga lubrificados de 1,5 ml	de Fósforo Costar	3207
	Molecular Dynamics	63-0034-79
Papel de filtro 3MM	Whatman	28458-005	VWR
Typhoon PhosphorImager	Software GE Healthcare	8600
ImageQuant GE	Healthcare	ver2003.02
Placas de Vidro TLC, PEI-Celulose F	Millipore	5725-7
Immobilon-FL 7 x 8.4	Millipore	IPFL07810
Medidor de pesquisa de uso geral com janela final ou panqueca Sonda GM (Geiger-Mueller)	Biodex	Modelo 14C

1143509400111435094001Tela de Armazenamento Membrana de Transferência