एक reprogrammable माउस मॉडल से आईपीएस सेल मध्यवर्ती की कोशिका की सतह मार्कर मध्यस्थता शोधन
Summary
Mouse embryonic fibroblast can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells at low efficiency by the forced expression of transcription factors Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. The rare intermediates of the reprogramming reaction are FACS isolated via labeling with antibodies against cell surface makers Thy-1.2, Ssea-1, and Epcam.
Abstract
Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of the body and consequently have vast potential for regenerative medicine applications. Traditionally iPS cells are generated by viral introduction of transcription factors Oct-4, Klf-4, Sox-2, and c-Myc (OKSM) into fibroblasts. However, reprogramming is an inefficient process with only 0.1-1% of cells reverting towards a pluripotent state, making it difficult to study the reprogramming mechanism. A proven methodology that has allowed the study of the reprogramming process is to separate the rare intermediates of the reaction from the refractory bulk population. In the case of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we and others have previously shown that reprogramming cells undergo a distinct series of changes in the expression profile of cell surface markers which can be used for the separation of these cells. During the early stages of OKSM expression successfully reprogramming cells lose fibroblast identity marker Thy-1.2 and up-regulate pluripotency associated marker Ssea-1. The final transition of a subset of Ssea-1 positive cells towards the pluripotent state is marked by the expression of Epcam during the late stages of reprogramming. Here we provide a detailed description of the methodology used to isolate reprogramming intermediates from cultures of reprogramming MEFs. In order to increase experimental reproducibility we use a reprogrammable mouse strain that has been engineered to express a transcriptional transactivator (m2rtTA) under control of the Rosa26 locus and OKSM under control of a doxycycline responsive promoter. Cells isolated from these mice are isogenic and express OKSM homogenously upon addition of doxycycline. We describe in detail the establishment of the reprogrammable mice, the derivation of MEFs, and the subsequent isolation of intermediates during reprogramming into iPS cells via fluorescent activated cells sorting (FACS).
Introduction
भ्रूणीय स्टेम (ते) कोशिकाओं ब्लास्टोसिस्ट चरण भ्रूण 1 की आंतरिक कोशिका द्रव्यमान से निकाली गई है. उचित संस्कृति शर्तों के तहत वे स्वयं को नवीनीकृत और pluripotent रहते हैं. 2006 में Yamanaka और सहयोगियों परिपक्व कोशिकाओं प्रतिलेखन के लिए मजबूर अभिव्यक्ति द्वारा तथाकथित प्रेरित pluripotent स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं में कारकों reprogrammed किया जा सकता है कि प्रदर्शन Oct-4, KLF-4, सॉक्स -2, सी MYC (OKSM) 2. आईपीएस कोशिकाओं, ES कोशिकाओं की तरह, शरीर की सभी प्रकार की कोशिकाओं को जन्म दे सकते हैं, हालांकि, वे ES कोशिकाओं 3 की पीढ़ी के आसपास के नैतिक बाधाओं से मुक्त हैं. इसके अलावा, आईपीएस कोशिकाओं व्यक्तिगत पुनर्योजी दवा का वादा ले और 4,5 स्क्रीनिंग रोग मॉडलिंग जैसे अनुप्रयोगों के लिए और इन विट्रो दवा में अपार क्षमता होती है. इस क्षमता को पूरा करने के लिए प्रौद्योगिकी reprogramming के लिए आदेश में, परमाणु reprogramming के बुनियादी तंत्र को पूरी तरह से समझने की जरूरत है. हालांकि, प्रयासों reprogramming पैट काटनाhway कोशिकाओं का केवल एक बहुत छोटी संख्या (0.1-1%) reprogram तथ्य यह है कि के द्वारा बाधा उत्पन्न किया गया है. सफलतापूर्वक reprogramming fibroblasts reprogramming, अंतर्जात कोर pluripotency नेटवर्क 11-14 की सक्रियता के अंतिम चरण में एक उपकला संक्रमण 6-10 को mesenchymal और, सहित घटनाओं की एक अलग श्रृंखला से गुजरना करने के लिए सूचित किया गया है. हम और दूसरों 12,13,15-17 हाल ही में आग रोक थोक आबादी से दुर्लभ मध्यवर्ती के अलग होने के लिए अनुमति देता है कि कोशिका की सतह मार्कर का एक सेट की पहचान की है. Reprogramming माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts 2 सप्ताह के लंबे reprogramming प्रक्रिया के दौरान 15 तेरा-1.2, Ssea1 और (दूसरों के बीच) Epcam की अभिव्यक्ति में परिवर्तन से गुजरना. प्रारंभिक MEFs के एक सबसेट reprogramming दौरान fibroblast पहचान मार्कर (तेरा-1.2) की अभिव्यक्ति नीचे विनियमित करने और फिर pluripotency जुड़े मार्कर SSEA -1 12 व्यक्त शुरू. Reprogramming Ssea1 पॉजिटिव कोशिकाओं के अंतिम चरण के दौरान Reactivऐसे Oct-4 10-13,15 के रूप में अंतर्जात pluripotency जीन खा लिया. यह पिछले संक्रमण detectable Epcam की अभिव्यक्ति (चित्रा 1 देखें) या एक बाद में मंच PECAM 15 में से कोशिका की सतह पर चिह्नित है. हाल ही में, पिता एट अल. Reprogramming मध्यवर्ती की पहचान के लिए तेरा-1.2 और SSEA-1 के लिए विकल्प या पूरक के रूप में CD44 और iCAM1 के उपयोग की सूचना दी. हम पहले से FACS इन कोशिका की सतह मार्कर 15,18 के आधार पर 0 दिन, दिन 3, दिन 6, 9 दिन और 12 दिन reprogramming संस्कृतियों से reprogramming मध्यवर्ती, साथ ही से स्थापित आईपीएस सेल लाइनों को निकाला है. नीचे वर्णित reprogramming प्रणाली और कानून के लिए हम आबादी के समरूप शांत कर रहे हैं, हालांकि, पहचान मध्यवर्ती आबादी में विविधता की एक निश्चित डिग्री है कि एकल कोशिका के स्तर पर पता चला है. यह इन आबादियों के भीतर कोशिकाओं की केवल एक सबसेट संबंधित अगले स्टेशन पर प्रगति करने में सक्षम हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिएreprogramming प्रक्रिया की जीई और बड़े पैमाने पर पहले से 15,19 विशेषता किया गया है जो विभिन्न क्षमता, पर आईपीएस सेल कालोनियों को जन्म दे. इसके अलावा, इन आबादियों के reprogramming दक्षता फिर से चढ़ाना और संस्कृति की स्थिति पर भी निर्भर करेगा. प्रयोगात्मक reproducibility बढ़ाने के लिए हम Rosa26 लोकस के नियंत्रण और एक डॉक्सीसाइक्लिन उत्तरदायी प्रमोटर 20,21 के नियंत्रण के अधीन एक polycistronic OKSM कैसेट के तहत एक ट्रांसक्रिप्शनल transactivator (m2rtTA) व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया गया है कि एक reprogrammable माउस तनाव का उपयोग करें. इस माउस मॉडल का उपयोग आईपीएस सेल पीढ़ी, यानी, संख्या और वायरल सम्मिलित का एकीकरण साइटों के स्थान में सेल परिवर्तनशीलता के लिए सेल के साथ एक विषम प्रारंभिक आबादी के पारंपरिक वायरल तरीकों की अवांछित दुष्प्रभावों में गतिरोध उत्पन्न. दो ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों (OKSM, m2rtTA), जैक्सन प्रयोगशाला में समयुग्मक संस्थापक जानवरों के रूप में उपलब्ध है, reprogra स्थापित करने के क्रम में पार करने के लिए हैmmable माउस मॉडल (चित्रा 2 देखें). इस पांडुलिपि में हम MEFs प्राप्त आईपीएस कोशिकाओं को उत्पन्न, और FACS द्वारा रूपांतरण की प्रक्रिया के विभिन्न चरणों में reprogramming मध्यवर्ती अलग करने के लिए कैसे विस्तार से वर्णन है.
Protocol
Representative Results
Discussion
सफलतापूर्वक आईपीएस कोशिकाओं में MEFs reprogram करने और उच्च मात्रा में reprogramming मध्यवर्ती शुद्ध करने के लिए आदेश में यह समग्र दक्षता पर प्रभाव पड़ता है कि कारकों के बारे में पता होना जरूरी है. विशेष रूप से FBS की बैच एक हानिकारक प्रभाव हो सकता आईपीएस मीडिया के पूरक के लिए इस्तेमाल किया. सामान्य सकारात्मक अनुभव में भ्रूण स्टेम (ते) सेल योग्य FBS लेकिन एक सस्ता विकल्प की पहचान हो सकती है विक्रेताओं की एक किस्म से सीरा की बैच परीक्षण के साथ किए गए थे.
Reprogramming दक्षता पर प्रभाव डालता है MEFs 15,20 के जीनोटाइप है कि एक और पहलू है. OKSM और reprogram है m2rtTA ठिकाना, homozygousity एक पर या उच्च reprogramming क्षमता में दोनों loci परिणाम दोनों के लिए चूहों विषमयुग्मजी (बेचैन) से ली गई MEFs है. हेट / हेट <होमो / हेट <बेचैन / होमो <होमो /: दरअसल, OKSM और m2rtTA पार की संतानों से व्युत्पन्न MEFs निम्नलिखित आदेश (OKSM / m2rtTA) में reprogramming दक्षता में वृद्धि शोहोमो (1 टेबल में दिए गए नंबर बेचैन / हेट जानवरों के लिए कर रहे हैं कि कृपया ध्यान दें). एक पुरुष होमोसेक्सुअल / होमोसेक्सुअल जानवर की पहचान की है दुर्लभ अवसर पर कई m2rtTA महिलाओं के साथ संभोग एक अन्त: पुर की स्थापना की जा सकती है. इन पार से सभी संतानों क्रमशः OKSM / m2rtTA loci के लिए / होमो बेचैन कर दिया जाएगा. प्रजनन के लिए युवा चूहों (उम्र के 6-15 सप्ताह) का उपयोग करते समय बड़ा litters प्राप्त कर रहे हैं के रूप में इसके अलावा, litters का तेजी से जीनोटाइपिंग की सिफारिश की है.
इसके अलावा, reprogramming के लिए कम बीतने MEFs का उपयोग 23 पर बल दिया है. MEFs एक normoxic टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में ली गई है और विस्तार किया गया तो हम दृढ़ता से केवल हालांकि बीतने 2 करने के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग करने की सलाह देते हैं, प्रयोगकर्ता MEFs की व्युत्पत्ति और विस्तार के लिए एक कम ऑक्सीजन इनक्यूबेटर एक्सेस (5% ऑक्सीजन) है, अभी भी अच्छे परिणाम 23 निकलेगा 3 के रूप में उच्च बीतने संख्या.
मामले में प्रयोगकर्ता reprogramming से जुड़ी समस्याओं का सामना करना पड़ता, बताया गया है कि सबसे अधिक संभावना स्पष्टीकरण Dox अलावा, गलत चूहों के जीनोटाइप या आईपीएस सेल पीढ़ी के लिए अनुकूल नहीं है कि FBS के उपयोग के समय में उच्च बीतने संख्या हैं. हालांकि, दुर्लभ मामलों में हम MEFs भी आदर्श परिस्थितियों में reprogram करने में सक्षम नहीं थे कि मनाया. इन मामलों में m2rtTA का खुला पढ़ने सीमा के भीतर एक सहज डी नोवो विलोपन अंतर्निहित कारण के रूप में पहचान की थी.
इस पद्धति का सफलतापूर्वक चुंबकीय सेल अलगाव (एमएसीएस) के माध्यम से SSEA -1 + मध्यवर्ती निकालने के लिए अनुकूलित किया गया था. एमएसीएस का उपयोग करने में एक स्पष्ट समय लाभ नहीं है, तथापि, SSEA -1 + सेल आबादी 'पवित्रता कोशिकाओं आ सकती है के लिए किस्मत में हैं प्रयोग के प्रकार पर निर्भर करता है जो 80-90%, के बजाय 95% से अधिक, कम है एक समस्या. इस प्रकार, एक विकल्प SSEA-1 / Epcam + और SSEA-1 / Epcam- कोशिकाओं में पवित्रता और / या अंश उन्हें बढ़ाने के लिए FACS द्वारा पीछा SSEA -1 + कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए एमएसीएस उपयोग करने के लिए है.
उल्लिखित प्रोटोकॉल और माउस मॉडल द्वारा उत्पादित आईपीएस कोशिकाओं pluripotent हो और प्रभावी ढंग से काइमेरिक जानवरों 15,20 के सभी ऊतकों में योगदान करने के लिए दिखाया गया है जबकि ">, पूरी तरह tetraploid complementation के माध्यम से इन आईपीएस कोशिकाओं से बना भ्रूण का उत्पादन करने के लिए एक कम क्षमता की गई है 24 का प्रदर्शन किया. DLK-Dio3 जीन क्लस्टर पर न्यायपालिका मेथिलिकरण पैटर्न अंतर्निहित कारण 24 के रूप में पहचान की गई है. हालांकि, reprogramming के दौरान मीडिया से 50 माइक्रोग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में एस्कॉर्बिक एसिड के अलावा tetraploid complementation सक्षम आईपीएस कोशिकाओं 24 का उत्पादन होगा. एक वैकल्पिक reprogrammable माउस मॉडल भी एस्कॉर्बिक एसिड उपचार 25 के अभाव में टेट्राप्लोइड सक्षम आईपीएस कोशिकाओं का उत्पादन कर सकते हैं एक अलग stoichiometry पर reprogramming कारकों व्यक्त करने के लिए इंजीनियर है कि कृपया सलाह दी है. हालांकि, हमारे हाथ कोशिकाओं में कम से काफी कम आवृत्ति की तुलना में इस तनाव reprogram से इस के साथ साथ इस्तेमाल किया माउस मोड परएल.इस पांडुलिपि में वर्णित पद्धति, जनसंख्या की आग रोक थोक से reprogramming मध्यवर्ती की जुदाई की अनुमति देता है और जैसे काटना और रूपरेखा के लिए एक unfractioned जनसंख्या का उपयोग करने वाले के पिछले सीमाओं को हटाने, reprogramming प्रक्रिया को समझने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण (के रूप में देखा जाना चाहिए आग रोक कोशिकाओं से उच्च संकेत शोर). यहाँ बताया एंटीबॉडी संयोजन हालांकि यह अतिरिक्त कोशिका की सतह मार्कर भी उच्च शुद्धता पर मध्यवर्ती प्राप्त करने की अनुमति होगी कि भविष्य में पर्दाफाश हो जाएगा कि संभव है, उच्च शुद्धता पर माउस कोशिकाओं से मध्यवर्ती के अलगाव की अनुमति देता है. SSEA -1 अभिव्यक्ति मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं की एक बानगी नहीं है और इस तरह इस प्रोटोकॉल के रूप में मानव की उत्पत्ति की कोशिकाओं reprogramming पर इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है कि कृपया ध्यान दें. अंत में, एक बार वर्णित विधि के साथ अलग reprogramming मध्यवर्ती अभिव्यक्ति profilin सहित आणविक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैजी, chromatin immunoprecipitation, methylome विश्लेषण, और प्रोटीन assays.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मोनाश लार्किंस कार्यक्रम से साथ ही एक NHMRC CDF और एक NHMRC परियोजना अनुदान से वित्तीय सहायता स्वीकार करना चाहते हैं. इसके अलावा, हम वीडियो के निर्माण में उनकी मदद के लिए उसे समर्थन और (विशेष एडम Dinsdale में) मोनाश Flowcore टीम के लिए, उसके रचनात्मक सुझाव के लिए एडविना McGlinn मुकदमा मेई लिम को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Anti-mouse CD90.2 (Thy1.2) Pacific Blue | eBioscience | 48-0902-82 | |
| Anti-Human/Mouse SSEA-1 Biotin | eBioscience | 13-8813 | |
| Streptavidin PE-Cy 7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| Anti- Mouse CD326(Epcam) Fitc | eBioscience | 48-5791-82 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Embryonic Stem Cell qualified Foetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10439024 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-070 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Propidium Iodide solution (PI) | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Gelatine from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Doxycyclin hyclate | Sigma-Aldrich | 33429-100MG-R | |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | Millipore | ESG1107 | |
| DMEM High Glucose | Life Technologies | 11960-044 | |
| DPBS (Dulbecco s phosphate buffer saline) | Life Technologies | 14190-144 | |
| KnockOut DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| Irradiated MEFs | Life Technologies | S1520-100 | |
| 75-cm2 Tissue culture flasks | Corning/BD Bioscience | 430641 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Corning/BD Bioscience | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Corning/BD Bioscience | 430829 | |
| Disposable surgical blades | Disposable surgical blades | 201 | |
| Cryogenic vials | Corning/BD Bioscience | 430487 | |
| 70 µm Cell strainer | BD Bioscience | 352340 | |
| Taq DNA Polymerase | Life Technologies | 10342-020 |
Referências
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