Vários modelos murinos de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) são amplamente utilizados em pesquisas sobre o cérebro experimental. Aqui, demonstramos o modelo de transcraniana permanente distal MCAO que produz enfarte cortical consistente de um tamanho correspondente ao dano imposto pela maioria dos acidentes vasculares cerebrais isquémicos humanos.
AVC é a terceira causa mais comum de morte e uma das principais causas de incapacidade em adultos adquirida em países desenvolvidos. Opções terapêuticas muito limitados estão disponíveis para uma pequena proporção de pacientes com AVC na fase aguda. A pesquisa atual está intensamente em busca de novas estratégias terapêuticas e está cada vez mais focados na fase sub-aguda e crônica após o AVC porque mais pacientes possam ser elegíveis para intervenções terapêuticas em uma janela de tempo prolongado. Estes mecanismos incluem atraso caminhos fisiopatológicos importantes, tais como a inflamação pós-acidente vascular cerebral, a angiogênese, a plasticidade neuronal e regeneração. Para analisar esses mecanismos e avaliar posteriormente alvos de novas drogas, os modelos AVC experimentais com relevância clínica, baixa mortalidade e alta reprodutibilidade são procurados. Além disso, os ratos são os mais pequenos mamíferos em que uma lesão acidente vascular cerebral focal pode ser induzida e para que um largo espectro de modelos transgénicos sãodisponível. Assim, descrevemos aqui o modelo de ratinho de transcraniana, coagulação permanente da artéria cerebral média por meio de electrocoagulação distais das artérias lenticulostriatal, o chamado "modelo de coagulação". O infarto resultando neste modelo está localizado principalmente no córtex; o volume de enfarte em relação em relação ao tamanho do cérebro corresponde à maioria dos acidentes vasculares cerebrais humanos. Além disso, o modelo de preencher os critérios de reprodutibilidade e baixa mortalidade acima mencionados. Neste vídeo podemos demonstrar os métodos cirúrgicos de indução AVC no "modelo de coagulação" e denunciar as ferramentas de análise histológica e funcional.
AVC é a terceira causa mais comum de morte e um dos principais motivos de incapacidade em adultos adquirido em países desenvolvidos 1. Cerca de 80% desta doença neurológica aguda é causada por isquemia cerebral resultante de uma obstrução do fluxo sanguíneo cerebral, enquanto cerca de 15% é causada por uma hemorragia intracerebral 2. Apesar de a investigação em curso, a administração intravenosa de ativador do plasminogênio tecidual é o único tratamento farmacológico aprovado para AVC isquêmico até agora e só está disponível para uma minoria de pacientes com AVC devido à janela de 4,5 horas após o AVC aparecimento 3,4 tempo curto aprovado. Como não existem modelos in vitro, que podem modelar corretamente as complexas interações entre o cérebro, vasos e mecanismos fisiopatológicos sistêmicos durante o curso, os modelos animais são essenciais para a pesquisa do curso pré-clínico.
Portanto, vários modelos de derrame isquêmico foram desenvolvidos em uma variáveledade de espécies. Um dos modelos de AVC mais vulgarmente utilizado é o "Modelo de filamento", em que um fio de sutura é transitoriamente introduzido na artéria carótida interna e encaminhada até a ponta oclui a origem da artéria cerebral média (MCA), resultando numa paragem do fluxo sanguíneo e posterior infarto cerebral de também regiões corticais e subcorticais no caso de oclusão prolongada 5,6. Em modelos photothrombotic de acidente vascular cerebral isquêmico, oclusão fotoquímica do navio cortical irradiado é alcançada após a injeção de um fotossensibilizador, resultando em pequenas lesões 7, circunscritos localmente. A oclusão permanente da MCA distais das artérias lenticulostriatal pode ser conseguida por uma ligação da artéria, a sua compressão transitória ou por 8,9 coagulação permanente. O enfarte resultante neste modelo afecta predominantemente o neocórtex 10 porque a oclusão da MCA neste modelo é distai ao lênticaulostriatal artérias, que fornecem os gânglios basais.
Uma vez que a maior parte das lesões de AVC humanos estão localizados no território da artéria cerebral média, todos os modelos comuns tempos assemelham oclusões da MCA ou de um dos seus ramos 11. A MCA é uma das principais artérias que proporciona o fornecimento de sangue para o cérebro; que surge a partir da artéria carótida interna, rotas ao longo do sulco lateral, onde, em seguida, filiais e projetos para os gânglios da base e as superfícies laterais do frontal, parietal e lobos temporais, incluindo o motor primário e córtex sensorial. A direita ea esquerda MCA estão conectados às artérias cerebrais anterior e posterior artérias, que se conectam com as artérias cerebrais posteriores comunicação, criando o círculo de Willis (Figura 1).
Como relatado anteriormente por Carmichael et al. 11, infartos modelados pela distal Cerebral Média Artery Oclusão (MCAO) modelo em camundongos abranger cerca de 10-15% do hemisfério, imitando assim a maioria das lesões tempos humanos, que estão localizados no território cortical MCA 11,12. Em 1981, Tamura et al. Descrito um modelo de coagulação transcraniana permanente, MCAO em ratos 8. No entanto, o modelo descrito por Tamura envolveu uma oclusão proximal da MCA, a fim de contornar a bifurcação mais distal da artéria. Assim, o "modelo Tamura" original induz não só as lesões corticais, mas também do corpo estriado, semelhantes às lesões obtidos por "modelo de filamento" 6. Aqui, descrevemos o modelo permanente OACM distal por eletrocoagulação transcraniana em camundongos. Além disso, relatamos histológica relacionada e métodos funcionais para analisar o resultado AVC neste modelo. Todos os métodos são baseados em procedimentos operacionais padrão desenvolvidos e utilizados em nossos laboratórios.
O presente protocolo descreve o modelo experimental de acidente vascular cerebral distal, OACM permanente por eletrocoagulação transcraniana – o chamado "modelo de coagulação". Este modelo, entretanto, tornar-se um dos modelos animais mais utilizados em pesquisa do curso experimental 12. Em comparação com outros modelos de isquemia cerebral focal, o modelo de coagulação, tal como apresentado neste vídeo tem a vantagem de um tempo muito curto, a operação de aproximadamente 10 min, quando realizado por um cientista treinado. Assim, os tempos breves de anestesia pode ser conseguida neste modelo, o que é uma característica favorável de um modelo de acidente vascular cerebral experimental porque o impacto dos anestésicos em neuroprotecção e derrame resultado é bem conhecido 15. Além disso, como anteriormente descrito por Carmichael et ai. 11, que demonstram que o volume do enfarte resultante e localização após distal coagulação permanente do MCA corresponde às lesões cerebrais isquémicas, na maioria dos humanosderrames em proporção ao tamanho do cérebro. Acidente vascular cerebral humano é principalmente de tamanho pequeno com lesões de, aproximadamente, 5-15% de hemisfério, com base em estudos populacionais anteriores e os ensaios clínicos de imagem 16-18, em contraste com lesões extensas com acidente vascular cerebral edema cerebral compressão que ocorrem em menos de 10% de cursos clínica 19. Deste modo, as lesões de AVC do território da ACM de cerca de 12% do hemisfério alcançado pelo modelo apresentado pode ser considerado como um volume de curso relevantes em translação. No entanto, tem que ser tomado em consideração que diferentes estirpes de ratos ou protocolos utilizados para anestesia pode afectar o volume da lesão que resulta 20.
A mortalidade durante o período de observação após a indução AVC neste modelo é praticamente ausente. A mortalidade total de menos de 5% é constituída principalmente de mortes durante a operação por causa de complicações anestesiológicas ou sacrifício porque chegando de critérios de exclusão. A fim de justificar a baixa variability deste modelo e sua excelente reprodutibilidade, sugerimos os seguintes critérios de exclusão: 1) Qualquer hemorragia subaracnóide durante a operação. 2) Tempo de operação mais de 15 min. 3) A recanalização da MCA depois de duas tentativas para eletrocoagulação com apenas OACM transitória. Além disso, os animais devem ser examinados diariamente após MCAO (comportamento fisiológico básico, a aparência da pele eo peso corporal) para controlar a dor, desconforto ou comportamento doentio.
Várias medidas podem ser implementadas para a análise do resultado do curso como medida speckle laser, ressonância magnética, testes comportamentais ou análise histológica. Neste protocolo, fornecer métodos exemplares para análise do comportamento e análise de volume de infarto. Vários teste para análise de comportamento após a isquemia cerebral focal têm sido desenvolvidos e utilizados em pesquisa do curso experimental. Testes adequados para a disfunção sensório-motor usado anteriormente pelo nosso grupo neste modelo AVC 21,22 nósre o teste Rotarod 23, teste de etiqueta adesiva 24, Canto teste 25 eo teste do cilindro 13, o que é demonstrado neste vídeo. O teste do cilindro consistentemente descreve assimetria do motor na fase aguda após distal MCAO permanente e também detecta recuperar consecutivo da função motora.
Apesar das vantagens óbvias, algumas limitações deste modelo de acidente vascular cerebral tem que ser tida em conta. Em primeiro lugar, é necessária uma trepanação do crânio, a fim de coagular a artéria, produzindo, assim, um acesso potencial de peri-operacionais infecções do cérebro, embora as infecções bacterianas da ferida cirúrgica, músculo temporal ou o próprio cérebro nunca ter sido detectado por nós mesmos ou documentados por outros usando esse modelo. Além disso, os danos mecânicos para o córtex e de coagulação, durante a preparação não pode ser excluída, mas pode ser limitada pela perfuração cuidadosa e remoção do crânio, humidificação constante do local de cirurgia e ne mínimo eletrocoagulação sário (ver critérios de exclusão). Embora o campo da MCA, conforme ilustrado na Figura 2 encontra-se na maioria dos ratinhos C57BL / 6, nós descrevemos o protocolo como proceder em variações normais do rumo do navio para minimizar a variabilidade modelo. Além disso, sugerimos o uso de múltiplas (3 no caso de bifurcação; 2 sem bifurcação dos MCA) sites de oclusão para minimizar o risco de recanalização parcial da MCA, que em nossa experiência é um fator importante para a variabilidade deste modelo.
Em termos de testes comportamentais, apenas os déficits comportamentais menores podem ser detectados nos testes comportamentais acima mencionados e regeneração funcional pode ser observado na primeira semana após o acidente vascular cerebral. Assim, os sistemas de teste mais avançados, com maior sensibilidade e parâmetros de teste qualitativo como o teste atingindo qualificados 27 pode ser mais adequado para detectar o resultado funcional a longo prazo neste modelo.
EOR "> Finalmente, devido à coagulação permanente do MCA não reperfusão pode ser obtido, que é uma característica observada numa percentagem substancial de pacientes com AVC, devido a lise de coágulos espontâneos ou terapia 28. No entanto, um modelo de acidente vascular cerebral tromboembólico anteriormente descrito 26 fornece a opção por um modelo de curso gratuito com a reperfusão de isquemia cerebral cortical. Tomados em conjunto, a alta reprodutibilidade, a possível observação a longo prazo devido à mortalidade mínimo eo volume de infarto em relação comparável e localização em relação ao acidente vascular cerebral humano distinguir o "modelo de coagulação" como um modelo valioso para a pesquisa básica e translacional derrame.The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo cluster de excelência da fundação de pesquisa alemão "Munich Cluster para sistemas Neurologia (Sinergia)" e pela fundação da Daimler-Benz para AL
Camera Canon Eos 500D | Canon | optics: 18-55 mm; 30 fps; 640×480 video function | |
Mirror | Kristallform | 2677089 | 30×30 cm |
Transparent acrylic glass cylinder | H&S Kunststofftechnik | diameter: 8 cm, height: 25 cm | |
Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
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Forceps | FST | 11616-15 | |
Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
Saline solution | Braun | 131321 | |
Bepanthen pomade | Bayer | ||
Isoflurane | Abbot | B506 | |
Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
Electrosurgical device | ERBETOM ICC 80/50 HF-Chirurgiegerät | ||
Drill | Proxxon | D-34343 | |
Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
Xylacine | Albrecht | ||
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Phosphate Buffered Saline PH: 7,4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
Isopentane | Fluka | 59070 | |
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Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
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Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 |