Olika musmodeller av mellersta cerebral artär ocklusion (kortex) används ofta i experimentell hjärnforskning. Här visar vi en modell av transkraniell permanent distal kortex som producerar konsekvent kortikal infarkt av en storlek som motsvarar skador som tas ut av de flesta mänskliga ischemisk stroke.
Stroke är den tredje vanligaste dödsorsaken och den huvudsakliga orsaken till förvärvad vuxen funktionshinder i utvecklade länder. Endast mycket begränsade terapeutiska alternativ är tillgängliga för en liten andel av strokepatienter i akutskedet. Aktuell forskning intensivt efter nya terapeutiska strategier och i allt högre grad fokuserar på subakut och kronisk fas efter stroke eftersom fler patienter skulle kunna vara berättigade till terapeutiska ingrepp i en längre tid. Dessa fördröjda mekanismer inkluderar viktiga patofysiologiska vägar såsom post-stroke inflammation, angiogenes, neuronal plasticitet och regeneration. För att analysera dessa mekanismer och att därefter utvärdera nya målproteiner, är experimentell stroke modeller med klinisk relevans, låg dödlighet och hög reproducerbarhet eftertraktade. Dessutom, möss är de minsta däggdjur, där en fokal stroke lesion kan induceras och för vilka ett brett spektrum av transgena modeller ärtillgängliga. Därför beskriver vi här musmodellen av transkraniell, permanent koagulering av den mellersta cerebrala artären via elektrokoagulation distala av de lenticulostriatal artärer, den så kallade "koagulation modell". Det resulte infarkt i denna modell ligger främst i cortex; den relativa infarktvolymen i förhållande till hjärnans storlek motsvarar de flesta mänskliga drag. Dessutom har modellen uppfyller de ovannämnda kriterierna för reproducerbarhet och låg dödlighet. I denna video visar vi de kirurgiska metoder för stroke induktion i "koagulering modellen" och rapportera histologiska och funktionella analysverktyg.
Stroke är den tredje vanligaste dödsorsaken och en de viktigaste skälen för förvärvade vuxen funktionshinder i utvecklade länder 1. Cirka 80% av denna akut neurologisk sjukdom orsakas av ischemi i hjärnan till följd av en förträngning i cerebralt blodflöde medan ca 15% orsakas av en intracerebral blödning 2. Trots pågående forskning, är intravenös administrering av vävnadsplasminogenaktivator den enda godkända farmakologisk behandling för ischemisk stroke hittills och bara tillgänglig för en minoritet av strokepatienter på grund av den korta godkända tidsfönster på 4,5 timmar efter strokedebut 3,4. Eftersom det inte finns några in vitro-modeller, som på rätt sätt kan modellera de komplexa sambanden mellan hjärnan, kärlsystemet och systemiska patofysiologiska mekanismer under stroke, djurmodeller är viktiga för preklinisk strokeforskning.
Därför har flera ischemisk stroke modeller utvecklats i en variabelhället av arter. En av de mest allmänt använda stroke-modeller är "filamentmodell", där en suturfilamentet transient införes i den inre halsartären och vidarebefordras till dess att spetsen ockluderar ursprunget av mellersta cerebrala artären (MCA), vilket resulterar i ett stopp av blodflödet och efterföljande hjärninfarkt av subkortikala och i händelse av långvarig ocklusion också kortikala regioner 5,6. I photothrombotic modeller av ischemisk stroke, är en fotokemisk ocklusion av det bestrålade kortikala kärl uppnås efter injektion av ett fotoresulterar i små, lokalt avgränsade lesioner 7. Den permanent ocklusion av MCA distala av de lenticulostriatal artärer kan uppnås genom en ligering av artären, dess övergående sammanpressning eller genom att permanent koagulering 8,9. Det resulte infarkt i denna modell påverkar främst neocortex 10 eftersom ocklusion av MCA i denna modell är distalt om lenticulostriatal artärer, som förser de basala ganglierna.
Eftersom majoriteten av mänskliga stroke lesioner är belägna inom territoriet för den mellersta cerebral artär, alla de vanliga strokemodeller liknar ocklusioner av MCA eller en av dess grenar 11. MCA är en av de större artärerna som ger blodtillförsel till hjärnan; den härrör från den inre halspulsådern, vägar längs den laterala sulcus där det då grenar och projekt till de basala ganglierna och sidoytorna på frontal, parietal och temporal lober, däribland den primära motoriska och sensoriska cortex. Den högra och vänstra MCA är anslutna till de främre hjärnans kärl och den bakre kommunicera artärerna, som ansluter till de bakre cerebrala artärer, skapar Circle of Willis (Figur 1).
Som tidigare rapporterats av Carmichael et al. 11, infarkter modelleras av den distala Middle Cerebral Arbatteri ocklusion (kortex) modell hos möss omfattar ca 10-15% av halvklotet, och därigenom härma en majoritet av mänskliga stroke lesioner som är belägna i den kortikala MCA territorium 11,12. År 1981 Tamura et al. Beskrev en permanent, transkraniell kortex koagulation modell på råttor 8. Men den modell som beskrivs av Tamura involverade en proximal ocklusion av MCA för att kringgå de mer distala förgrening av artären. Således, den ursprungliga "Tamura-modellen" framkallar inte bara bark men även striatala lesioner, som liknar de skador som erhållits genom "glödtrådsmodellen" 6. Här beskriver vi den permanenta distala MCAO-modell av transkraniell elektrokoagulation i möss. Dessutom rapporterar vi tillhörande histologiska och funktionella metoder för att analysera slag utfallet i denna modell. Alla metoder är baserade på standardrutiner som utvecklats och används i våra laboratorier.
Föreliggande protokoll beskriver experimentell stroke-modell av distal, permanent MCAO av transkraniell elektrokoagulation – den så kallade "koagulering modellen". Denna modell har under tiden blivit en av de mest använda djurmodeller i experimentell stroke forskning 12. Jämfört med andra fokala hjärnischemimodeller, modellen koagulation som presenteras i denna video har fördelen av en mycket kort driftstid på ungefär 10 min när de utförs av en utbildad vetenskapsman. Därför kan korta anestesi tider uppnås i denna modell, vilket är ett positivt inslag i en experimentell stroke modellen eftersom effekten av bedövningsmedel för neuroprotektion och stroke resultatet är välkänt 15. Dessutom, såsom tidigare beskrivits av Carmichael et al. 11, bekräftar vi att den resulterande infarktvolymen och lokalisering efter distala permanent MCA koagulation motsvarar ischemiska hjärnskador i majoriteten av humanaslag i förhållande till hjärnans storlek. Human stroke är huvudsakligen små i storlek med skador på cirka 5-15% av halvklotet, baserat på tidigare populationsstudier och kliniska avbildnings prövningar 16-18, i motsats till omfattande stroke lesioner med tryckhjärnödem, som förekommer i mindre än 10% av klinisk stroke 19. Därigenom kan stroke lesioner i MCA territorium på cirka 12% av halvklotet uppnås av presenterade modellen ses som ett translationellt relevant slagvolym. Emellertid måste man ta hänsyn till att olika musstammar eller begagnade anestesiprotokoll kan påverka den resulterande lesionen volym 20.
Dödlighet under observationsperioden efter stroke induktion i denna modell är så gott som frånvarande. Den totala dödligheten på mindre än 5% utgörs främst av dödsfallen under drift på grund av anesthesiological komplikationer eller offer, eftersom att nå av uteslutningskriterier. För att motivera den låga variability av denna modell och dess utmärkta reproducerbarhet, föreslår vi följande exklusionskriterier: 1) Alla subaraknoidalblödning under operationen. 2) Drift tid längre än 15 minuter. 3) Recanalization av MCA efter två försök för elektrokoagulering med endast övergående kortex. Dessutom djur måste undersökas dagligen efter kortex (grundläggande fysiologiska beteende, päls utseende och kroppsvikt) för att kontrollera för smärta, obehag eller sjukdom beteende.
Flera åtgärder skulle kunna genomföras för analys av stroke utfall som laser speckle mätning, magnetisk resonanstomografi, beteendetester eller histologisk analys. I detta protokoll ger vi föredömliga metoder för beteendeanalys och infarktvolym analys. Flera test för beteendeanalys efter fokal hjärnischemi har utvecklats och använts i experimentell stroke forskning. Lämpliga tester för sensorimotor dysfunction tidigare använts av vår grupp i detta slag modell 21,22 vire Rotarod testet 23, Sticky etikettprov 24, Corner testet 25 och cylindertestet 13, vilket visar sig i den här videon. Cylinder testet visar genomgående motor asymmetri i den akuta fasen efter distal permanent kortex och även upptäcker rad återfå av motorisk funktion.
Trots de uppenbara fördelar, vissa begränsningar av denna slaglängd modell måste beaktas. För det första behövs ett trepanation av skallen för att koagulera artären, varigenom en potentiell tillgång för peri-operativa infektioner i hjärnan, även om bakteriella infektioner i operationssår, temporal muskel eller hjärnan själv aldrig har upptäckts av oss själva eller dokumenteras av andra som använder denna modell. Dessutom kan mekaniska skador på hjärnbarken under beredning och koagulation inte uteslutas men kan begränsas genom noggrann borrning och borttagning av skallen, konstant fuktning av operationsområdet och minimal ne vändig elektrokoagulering (se uteslutningskriterier). Även om loppet av MCA som visas i figur 2 återfinns i de flesta C57BL / 6 möss, vi beskriver i protokollet hur man ska gå vidare i normala variationer av fartygets kurs för att minimera modell variabilitet. Dessutom föreslår vi att använda multipla (3 vid bifurkation, 2 utan bifurkation av MCA) ocklusion webbplatser för att minimera risken för partiell omkanalisering av MCA, som enligt vår erfarenhet är en viktig faktor för variationer i denna modell.
I termer av beteendetester, kan endast mindre beteendestörningar detekteras i de ovan nämnda beteendetester och funktionell regenerering kan observeras inom den första veckan efter stroke. Således kan mer avancerade testsystem med högre känslighet och kvalitativa testparametrar såsom skickliga nå testet 27 vara mer lämpade för att upptäcka långsiktiga funktionella resultatet i denna modell.
ontent "> Slutligen ger dock en tidigare beskrivna tromboembolisk stroke modell 26 på grund av den permanenta koagulering av MCA ingen reperfusion kan erhållas, vilket är en funktion som observerats i en betydande andel av strokepatienter på grund av spontan trombolys eller terapi 28. alternativet för en gratis stroke-modell med reperfusion av kortikal hjärnischemi. Sammantaget hög reproducerbarhet, den möjliga långsiktiga observation på grund av minimal dödlighet och den jämförbara relativa infarktvolym och lokalisering i förhållande till människans stroke särskilja "koagulering-modellen" som en värdefull modell för grundforskning och translationell strokeforskning.The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av spetskompetens kluster av den tyska forskningsstiftelsen "München Cluster för Systems Neurology (Synergy)" och av Daimler-Benz grunden till AL
Camera Canon Eos 500D | Canon | optics: 18-55 mm; 30 fps; 640×480 video function | |
Mirror | Kristallform | 2677089 | 30×30 cm |
Transparent acrylic glass cylinder | H&S Kunststofftechnik | diameter: 8 cm, height: 25 cm | |
Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
Forceps | FST | 11616-15 | |
Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
Saline solution | Braun | 131321 | |
Bepanthen pomade | Bayer | ||
Isoflurane | Abbot | B506 | |
Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
Electrosurgical device | ERBETOM ICC 80/50 HF-Chirurgiegerät | ||
Drill | Proxxon | D-34343 | |
Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
Xylacine | Albrecht | ||
5ml Syringe | Braun | ||
Phosphate Buffered Saline PH: 7,4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
Isopentane | Fluka | 59070 | |
Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 |