בימוי דופאמין Neuron בידול מתאי גזע pluripotent האדם
Summary
We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson’s disease.
Abstract
Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson’s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.
Introduction
ניתן למצוא נוירונים דופאמין (DA) במספר אזורים במוח, כולל המוח התיכון, ההיפותלמוס, רשתית, ונורות חוש הריח. נוירונים A9 DA בסעיפי nigra substantia compacta (SNpc) שליטת ההתנהגות ותנועה על ידי הקרנה לסטריאטום במוח הקדמי ולהרכיב את המערכת המוטורית אקסטרה. ניוון של תאי עצב A9 DA מוביל למחלת פרקינסון (PD), המהווה את ההפרעה השנייה בשכיחותה האנושית ניווניות וחשוכות מרפא כיום. טיפול בתחליפי תא הוא אחת האסטרטגיות המבטיחות ביותר לטיפול במחלת פרקינסון 1, ולכן, חלה התעניינות רבה בנובעים נוירונים A9 DA מתאי גזע pluripotent אנושיים (hPSCs), כולל שני תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ו התאים אחרונים אנושיים מושרה גזע pluripotent (hiPSCs).
מחקרים רבים ניסו להפיק תאי עצב A9 DA מhPSCs תוך שימוש בשיטות שונות. דיווחים המוקדמים כל הנוירונים DA שנוצרו באמצעות עצבישלב אב שושנה. על ידי שיתוף culturing עם MS5 2 או PA6 3-5 תאי סטרומה, עם או בלי גורמי גדילה חיצוניים ל2-4 שבועות, ל 'Studer ועמיתים ושלוש קבוצות אחרות מושרה בהצלחה hESCs לייצר רוזטות העצבית. לאחר מכן הם העשירו את רוזטות אלה על ידי נתיחה מכאנית או עיכול אנזימטי להבחנה נוספת. בדיווחים אחרים, חוקרים שנוצרו רוזטות העצבית דרך גוף embryoid (EB) צף בידול תרבות 6-9. מאוחר יותר, חוקרים שהוקמו בשיטת monolayer מבוססת בידול 10,11, שבו הם מצופים hESCs וhiPSCs על מטריצה סלולרית נוספת, הוסיפו גורמי גדילה שונים בתרבות כדי לגרום להתמיינות של hPSCs לתאי עצב DA, אשר מחקה בפיתוח נוירון DA העוברי vivo . למרות שכל המחקרים הללו הושגו hydroxylase טירוזין (TH) תאי -expressing עם כמה מאפיינים של תאי עצב DA, תהליך ההתמיינות כל הוא זמן רב ועבודה,בדרך כלל לא יעיל, ויותר מכך, זהות A9 של נוירונים אלה לא באו לידי ביטוי במרבית המחקרים מלבד אחד עם ביטוי אקטופי LMX1a 12. לאחרונה, צלחת רצפה חדשה (FP) פרוטוקול מבוסס פותחה 13-16, שבו מבשרי FP עם פוטנציאל נוירון DA נוצרו לראשונה על ידי הפעלה של הקיפוד הקולי ומסלולי Wnt הקנונית איתות בשלב המוקדם של בידול, ולאחר מכן תאי FP אלה שצוינו בהמשך לתאי עצב DA. למרות שפרוטוקול זה הוא יעיל יותר, יש עדיין כמה בעיות; למשל, תהליך ההתמיינות השלם לוקח זמן רב (לפחות 35 ימים), והוא תא המזין תלוי 15, או היא EB תלויה 16 או זהות A9 לא הפגינה 14.
כאן, המבוססים על הידע מפיתוח in vivo עוברי תא עצב DA והתוצאות שפורסמו של חוקרים אחרים, יש לנו מותאם לתנאי התרבות לeffדור icient של נוירונים DA משני hESCs וhiPSCs. אנחנו שנוצרנו ראשון תאי מבשר FP על ידי הפעלה של האיתות של Wnt הקנונית עם המולקולה קטנה CHIR99021 וסוניק קיפוד איתות עם מולקולות קטנות SAG וpurmorphamine. תאי FP אלה מבטאים FOXA2, LMX1a, קורין, OTX2 וNestin. לאחר מכן, אנו שצוינו תאי FP אלה לתאי עצב DA עם גורמי צמיחה כולל BDNF, GDNF, וכו '. נוירונים DA שנוצרו הם מסוג תא A9 כפי שהם חיוביים לGIRK2 תוך שלילי לCalbindin 17. פרוטוקול זה הוא תא מזין או עצמאי EB, יעיל ומאוד לשחזור. שימוש בפרוטוקול זה, אחד יכול להפיק תאי עצב DA בפחות מ -4 שבועות מhESCs או hiPSCs של אנשים רגילים למחקר השתלת תאים, או מhiPSCs של חולי פרקינסון לדוגמנות במבחנה של PD או בדיקת סוכנים טיפוליים פוטנציאליים עבור PD.
Protocol
Representative Results
Discussion
תאי גזע pluripotent אדם (כולל שני hESCs וhiPSCs) יכולים להיות מובחנים במבחנה כדי לייצר רוב, אם לא כולם, סוגי תאים של הגוף שלנו, כולל תאי עצב DA, שהודגם במחקרים קודמים 19. כאן, המבוסס על ידע מפיתוח נוירון דופאמין העוברי 20 ופרוטוקולים שפורסמו ממעבדות אחרות 14,15, אנ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank members of the Renee Reijo Pera laboratory for help during development of this protocol and during preparation of this manuscript. This work is supported by California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) shared laboratory (CL-00518).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
Referências
- Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
- Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
- Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, 669-674 (2004).
- Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, 925-940 (2004).
- Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
- Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
- Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
- Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson’s disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
- Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
- Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson’s disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson’s disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
- Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).
