Nós, com base no conhecimento da biologia do desenvolvimento e pesquisas publicadas, desenvolvemos um protocolo otimizado para gerar com eficiência neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo A9 a partir de células-tronco embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas humanas, o que seria útil para modelagem de doenças e terapia de substituição celular para a doença de Parkinson.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os neurônios dopaminérgicos (DA) na substância negra pars compacta (também conhecidos como neurônios A9 DA) são o tipo específico de célula que é perdido na doença de Parkinson (DP). Há um grande interesse em derivar neurônios A9 DA de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para terapia de reposição celular regenerativa para DP. Durante o desenvolvimento neural, os neurônios A9 DA se originam dos precursores da placa de assoalho (FP) localizados na linha média ventral do sistema nervoso central. Aqui, otimizamos as condições de cultura para a diferenciação gradual de hPSCs em neurônios A9 DA, que imita o desenvolvimento embrionário do neurônio DA. Em nosso protocolo, primeiro descrevemos a geração eficiente de células precursoras de FP a partir de hPSCs usando um método de molécula pequena e, em seguida, convertemos as células FP em neurônios A9 DA, que podem ser mantidos in vitro por vários meses. Este protocolo eficiente, repetível e controlável funciona bem em células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) de pessoas normais e pacientes com DP, nas quais se pode derivar neurônios A9 DA para realizar modelagem de doenças in vitro e triagem de drogas e terapia de transplante de células in vivo para DP.
Introdução
Dopaminérgico (DA) neurônios pode ser encontrada em várias regiões do cérebro, incluindo o mesencéfalo, hipotálamo, retina, e bulbos olfatórios. Os neurônios A9 DA na substância negra pars compacta (SNPC) comportamento de controle e movimento, projetando para o estriado na parte frontal do cérebro e formando o sistema motor extrapiramidal. A degeneração de neurónios DA A9 leva à doença de Parkinson (PD), que é a segunda doença neurodegenerativa mais comum e humano actualmente incurável. A terapia de substituição de células é uma das mais promissoras para o tratamento da DP 1, por conseguinte, tem havido um grande interesse na determinação neurónios A9 DA a....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1 Preparação de Meios de Cultura
- Prepare de fibroblastos de rato embrionário (MEF) forma, combinando o seguinte: 445 ml de DMEM, 50 mL de soro bovino fetal (FBS), e solução de reserva de 5 ml de 100x penicilina / ampicilina. Mantenha o filtro meio esterilizado a 4 ° C por não mais que 14 dias.
- Prepare HPSC meio de cultura através da combinação do seguinte contendo soro: 385 ml de DMEM / F12, 100 ml de soro de substituição nocaute (KSR), 5 ml de 100x não essencial solução solução de estoque de aminoácidos, 5 ml penicilina 100x / estoque ampicilina, 5 ml de 100x mercaptoetanol a solução estoque, e 10 ng / ml de bFGF. Mantenha o filtro meio esterili....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Uma visão geral do protocolo de diferenciação é mostrado na Figura 1. A eficiência da diferenciação protocolo aqui apresentada baseia-se no estado das células iniciadoras. Portanto, é essencial ter a certeza de que, em primeiro lugar um remove todas as colónias diferenciadas antes dissociando hPSCs em células individuais de diferenciação, e, segundo, uma esgota a maioria, se não todas, as células alimentadoras MEF por incubação das células em placas revestidas com gelatina durante 30 min, e em terceiro .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
As células estaminais pluripotentes humanas (incluindo ambos os hESCs e hiPSCs) podem ser diferenciadas in vitro para gerar a maioria, se não todos, os tipos de células do nosso corpo, incluindo neurónios DA, o que foi demonstrado em estudos anteriores 19. Aqui, com base no conhecimento do desenvolvimento embrionário neurônio dopaminérgico 20 e protocolos publicados a partir de outros laboratórios 14,15, otimizamos as condições de cultura para a geração de neurônios DA de hESCs .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores agradecem aos membros do laboratório Renee Reijo Pera pela ajuda durante o desenvolvimento deste protocolo e durante a preparação deste manuscrito. Este trabalho é apoiado pelo laboratório compartilhado do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM) (CL-00518).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicilina/ampicilina | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Aminoácido não essencial | Life Tecnologias | 11140-050 | |
| b-mercaptoetanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R& D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Colagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatina | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Suplemento N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Suplemento B27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Fator de crescimento reduzido matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R & D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R& D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R& D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R& D Systems | 243-B3-002 | |
| Ácido ascórbico | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Camundongo anticorpo NESTIN humano | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | /1.000 diluição |
| Coelho anti humano OTX2 anticorpo | Millipore | AB9566 | 1/2.000 diluição |
| Cabra anti humano FOXA2 anticorpo | R& D Systems | AF2400 | 1/200 diluição |
| coelho anti humano LMX1a anticorpo | Millipore | AB10533 | 1/1.000 diluição |
| Coelho anti humano TH anticorpo | Pel Freez | P40101 | /500 diluição |
| Frango anti humano TH anticorpo | Millipore | AB9702 | 1/500 diluição |
| Camundongo anti humano TUJ1 anticorpo | Covance | MMS-435P | 1 /, 2000 diluição |
| Abcam | abcam ab30738 | coelho anti GIRK2 | /300 |
| Anticorpo | Abcam | abcam ab25085 | 1/400 da diluição |
| Eppendorf | 5804 |
Referências
- Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
- Perrier, A. L., et al.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
