Concentre Formação: Um Ensaio Celular para Determinar o Potencial oncogénica de um Gene

Resumo

O ensaio de formao de foco fornece um método simples para avaliar o potencial de transformação de um oncogene candidato.

Resumo

A transformação maligna das células está tipicamente associada ao aumento da proliferação, perda da inibição de contato, aquisição de potencial de crescimento independente de ancoragem e capacidade de formar tumores em animais experimentais¹. Nas células NIH 3T3, a via de transdução de sinal Ras é conhecida por desencadear muitos desses eventos, o que é conhecido como transformação Ras. A introdução de um gene superexpresso em células NIH 3T3 pode promover transformação morfológica e perda de inibição de contato, o que pode ajudar a determinar o potencial oncogênico desse gene de interesse. Um ensaio que fornece um método direto para avaliar um aspecto do potencial transformador de um oncogene é o Ensaio de Formação de Foco (FFA)². Quando as células NIH 3T3 se dividem normalmente em cultura, elas o fazem até atingirem uma monocamada confluente. No entanto, na presença de um oncogene superexpresso, essas células podem começar a crescer em focos¹ densos e multicamadas que podem ser visualizados e quantificados por cristal violeta ou coloração Hema 3. Neste artigo, descrevemos o protocolo FFA com transdução retroviral do gene de interesse em células NIH 3T3 e como quantificar o número de focos por meio de coloração. A transdução retroviral oferece um método mais eficiente de entrega de genes do que a transfecção, e o uso de um retrovírus murino ecotrópico fornece um controle de biossegurança ao trabalhar com potenciais oncogenes humanos.

Introdução

As células tumorais podem ser distinguidos dos seus homólogos normais por uma ampla gama de alterações, a partir de padrões de expressão de genes para epigenomics a alterações morfológicas e proliferativas. Entre estes últimos, redução da dependência do soro, a perda de contacto (densidade) de inibição, a aquisição de proliferação independente de ancoragem e, em última análise, a capacidade de formar tumores quando injectadas em animais são indicadores úteis, mensuráveis ​​de transformação maligna ^3. Vários in vitro e em ensaios in vivo têm sido desenvolvidos para a transformação celular. Os ensaios in vitro por objectivo a ident....

Protocolo

1. Fazer os vetores virais

As sequências de codificação para o gene de interesse, bem como os controlos positivos e negativos, são inseridos em pBABEpuro por métodos tradicionais de clonagem (amplificação por PCR, digestão de restrição e de ligação). Existem quatro locais de restrição no vector em que o DNA pode ser inserido: BamHI, SnaBI, EcoRI e Sall.

1. Prepare plasmídeo DNA transfecção-grade a partir de células competentes, segundo o kit plasmídeo midi QIAGEN.
2. Medir a concentração de DNA usando um espectrofotômetro NanoDrop2000.

2. Retrovirus Produção

A li....

Resultados

MXD3 é um fator fundamental zipper hélice-alça-hélice leucina (bHLHZ) de transcrição que é um membro da MYC / MAX / network MAD. Ele é um membro da família atípica MAD ^13-15, e tem sido referida como estando envolvida na carcinogénese ^16,17. Quando comparado com pBABEpuro (controlo negativo) e MYC (controlo positivo), os pratos de NIH 3T3 que sobre-expressas foi MXD3 tinham significativamente menos focos (Figura 1A). Os dados na Figura 1B foram recolhidos a partir .......

Discussão

A FFA fornece um método rápido e fácil de avaliar a transformação maligna in vitro. É passível de exibição de um número relativamente grande de genes candidatos e seus requisitos técnicos modestos torná-lo rentável. Além disso, dois ou mais genes pode ser co-expressa (por vezes referido como um ensaio de "cooperação") para avaliar o potencial tumorigénico de combinação. As vantagens deste ensaio contar com a sua técnica simples, a sua facilidade de quantificação e a sua relativamente curto tempo de ro.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
pBABE-puro vetor	Addgene	Plasmid 1764	vetor de clonagem
Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic	Cell Biolabs, Inc.	Linha celular RV-101	para produção viral
NIH 3T3 Linha celular murina	Sigma-Aldrich	93061524	linha celular para ensaio de formação de foco
Seringa de ponta BD Luer-Lok de 10 ml	BD Biosciences	309604	reagente de produção viral
0,45 μ m Filtro de Seringa Puradisc	Reagente de produção viral	da Whatman	6750-2504Polysciences
	, Inc.	23966-2	reagente de transfecção de células
Infecção de Polybrene / Reagente de transfecção	EMD Millipore	TR-1003-G	reagente de transfecção de células
Crystal Violet	Fisher Scientific	C581-25	reagente de coloração de células
Plasmid Plus Midi Kit	QIAGEN	12945	purificação de plasmídeos Placas
cultura de tecidos BD Falcon	Biosciences	353003	Suprimentos para cultura de células
Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)	Gibco	11995-065	meio de cultura celular
0,05% Tripsina-EDTA	Gibco	25300-054	suprimentos de cultura de células
Opti-MEM I Meio de Soro Reduzido	Gibco	31985-062	meio de cultura de células
Soro Fetal Bovino (FBS)	Gibco	16000-044	meio de cultura de células

de polietilenonimina (PEI) de BD