Samtidige ekstracellulære langsigtede optagelser fra to forskellige hjerne neuropiles eller to forskellige anatomiske skrifter blev etableret i honningbier. Disse optagelser tillader undersøgelse af tidsmæssige aspekter af neuronal behandling på tværs af forskellige områder i hjernen på enkelt neuron samt på ensemblet niveau i en opfører dyr.
I begge pattedyr og insekter neuronal oplysningerne behandles i forskellige højere og lavere orden centre i hjernen. Disse centre er koblet via konvergerende og divergerende anatomiske forbindelser, herunder til foder frem og feedback ledninger. Desuden er oplysningerne af samme oprindelse delvist sendes via parallelle veje til forskellige og undertiden i de samme områder i hjernen. For at forstå de evolutionære fordele samt de beregningsmæssige fordele af disse ledninger strategier og især deres timelige afhængigheder på hinanden, er det nødvendigt at have samtidig adgang til enkelte neuroner i forskellige skrifter eller neuropiles i samme forberedelse med høj tidsmæssig opløsning. Her koncentrerer vi på honningbier ved at demonstrere en unik ekstracellulært langsigtet adgang til at optage flere enheds aktivitet ved to efterfølgende neuropiles 1, den antennal lap (AL), den første olfaktoriske forarbejdningstrin og champignon krop (MB), en højere orden integration center INVOlved i indlæring og hukommelse dannelse, eller to parallelle neuronale skrifter 2 sammenhængende AL med MB. Sidstnævnte blev valgt som et eksempel og vil blive beskrevet fuldt ud. I den bærende video konstruktion og permanent indføring af fleksible multi kanal trådelektroder demonstreres. Parvis differentialforstærkning de mikroorganismer trådelektrode kanaler drastisk reducerer støj og kontrollerer, at signalkilden er tæt knyttet til positionen af elektrodespidsen. Den mekaniske fleksibilitet af de anvendte trådelektroder giver stabile invasive langsigtede optagelser over mange timer til dage, hvilket er en klar fordel i forhold til konventionelle ekstra og intracellulære in vivo optagelse teknikker.
Honningbier såvel som de fleste andre insekter er stærkt afhængige af lugtesansen. Blandt andet bruger de olfaktoriske tidskoder til orientering, parring, kommunikation med artsfæller, og fouragering. Deres godt udarbejdet olfaktoriske system bidrager til et rigt repertoire af læring adfærd i tilknytning til blomstermotiver lugt stimuli. Disse adfærdsmønstre kan nemt studeres under kontrollerede laboratorieforhold (til gennemgang se 3 – 5). Deres "mini hjerner" (sml. 6) med deres relativt lille antal neuroner gør honningbien en velegnet model organisme for at studere olfaktoriske kodning og læring under overvågning af neurale aktivitet.
Den olfaktoriske system i insekter samt i pattedyr viser analog organisation i stor udstrækning (for en oversigt, se 7,8). I honningbier omkring 80.000 receptor neuroner 9 beliggende i sensillae langs antenner 10,11 oversætte den miljømæssige lugt stimulus i en NEUROnal signal. Axoner fra olfaktoriske receptor neuroner innerverer antennal lap (AL), som har en glomerulær organisation sammenlignes med hvirveldyr lugtekolben. Den AL består af omkring 164 glomeruli sammenkoblet med hinanden ved omkring 4.000 lokale interneuroner (LN) (for en oversigt, se 12). Især i honningbi det blevet vist for nylig, at LN giver pletvis lateral tilslutning og at forskellige subpopulationer besidder grundstoffer og configural olfaktoriske kodende egenskaber 13,14. AL blev vist til at blive opdelt i en ventral og en dorsal hemi lap giver anledning til den mediale og den laterale antennal lap tarmkanalen (m-og l-ALT, tidligere betegnet m-og L-APT for medial-og lateral antennal lap protocerebral tarmkanalen 15-17). Her er en ny tarmkanalen terminologi indført ved en nylig indsats for en fælles nomenklatur for insekt hjerne vil blive brugt 18 år. Begge ALT'er (L-og M-ALT) kombinere enten 410 (l-ALT) eller 510 (m-ALT) uniglomerular ProjeIndsatsen neuroner (PN), henholdsvis 15,16,19. PNS begge skrifter er for nylig blevet vist at kode lugte parallelt 2 (for en gennemgang se 17,20), og begge skrifter synaptisk danne divergerende forbindelser med Kenyon celler (KC), svampe krop (MB) primære neuroner. Hver MB indeholder omkring 172.000 KCS 21 – 23. MBS er kendt for at være involveret i stimulus integration, læring og hukommelse dannelse. De AXO dendritter af KCS danne Skaftet (svampens stilk), som har to primære output regioner: den Vertica eller alfa-lap og den vandrette eller beta-lap 22,24. Udgangen af MB konvergerer mod kun omkring 400 ydre neuroner (EN) 24. Ens ansvarlig for olfaktoriske informationsbehandling meste innerverer den ventrale aspekt af den lodrette lap 22. For nylig er det blevet påvist, at EN'erne optaget på dette område indkode lugt belønning forening 25.
Temporal sompects inden for det olfaktoriske system af insekter samt hvirveldyr er blevet et vigtigt og væsentligt aspekt som en potentiel kodning princip 26 – 29. At være i stand til samtidigt at optage flere neuroner fra forskellige steder med høj tidslig opløsning, vi etableret dobbelt multi enhed optagelse teknikker hjælp Customized multikanal trådelektroder introduceret til forskellige målgrupper regioner i biens olfaktoriske system. Denne tilgang gør det muligt for os at analysere og sammenligne tidsmæssig forarbejdning i honningbien olfaktoriske system på niveauet af enkelte neuroner og populationer af neuroner enten mellem parallelle olfaktoriske veje, den dobbelte olfaktoriske vej 2 eller mellem forskellige efterfølgende neuropils 1. For nylig med en tilsvarende eksperimentel tilgang i Græshoppen olfaktoriske system 30 ved hjælp af en anden konfiguration af elektroder var i stand til at analysere Spatiotemporal kodning mekanisme til background-invariant lugt anerkendelse 31. Thos, skal du aktivere de etablerede dobbelte optagelser indsamling geografisk information om samtidige neuronal aktivitet profiler.
I forhold til den bredere rumlige prøvetagning fås fra calcium imaging denne metode giver mulighed for optagelse fra kun to pletter. Men den fordel i forhold til calcium imaging teknikker er høj tidslig præcision af action potentielle optagelser, som ikke kan leveres af enten konventionel CCD imaging eller 2-foton imaging erhvervelse. De ekstracellulære elektroder beskrevet her er permanent implanteret og fastgjort i forhold til hjernen og hovedet kapsel undgå elektrode afdrift. Dette er en klar fordel i forhold til brugen af skarpe intracellulære elektroder. En anden fordel i forhold til intracellulære optagelser og calcium billeddannelse er den udvidede neurale observationstid spænder fra mange timer til dage. Dette er en vigtig forudsætning for at undersøge neurale korrelater for indlæring og hukommelse dannelse. Yderligere fordele ved multiunit optagelser er yderligere skitseret i diskussionen afsnit.
I denne metodiske overblik fremstillingssektoren for brugerdefineret design trådelektroder vil blive vist, tilpasset fra 32,33 og velegnet til langsigtede multi unit optagelser i honningbien hjernen. Derudover et eksempel hvordan disse typer af elektroder er permanent implanteret på to forskellige kontrolapparater sites inden honningbien olfaktoriske system til at registrere samtidigt L-og m-ALT over lange perioder af tid til at tillade mange stimulationsregimer er vist 2. Til verifikation af optagelsen positioner et eksempel og protokol til farvning og post-optagelse visualisering af optagelsen sites er forudsat.
Denne artikel viser produktion og anvendelse af special designet multi kanals mikro wire-elektroder. De beskrevne elektroder er velegnet til optagelse både enkelt enhed og befolkning aktivitet, som er specielt velegnet til latency målinger og andre tidsmæssige respons egenskaber af forskellige neuroner og forskellige neuropils inden for et enkelt eksemplar (for detaljer se 1,2,25). Derudover har vi vist, hvordan man permanent gennemføre de mikro trådelektroder at give stabile langsigtede optagelser i opfører honningbier, der holder i timer op til dage.
Ekstracellulære multi-unit optagelser blev et gunstigt middel til at opnå høj tidsmæssig opløsning kombineret med geografisk information. I vores tilfælde er disse enten parallelle neuronale skrifter 2 eller to forskellige neuropils 1. Flere neuroner kan registreres og analyseres på enkelt neuron niveau parallelt og i høj tidslig opløsning. Multi-enhed rekordheder blev først anvendt i pattedyr 38 og senere også i insekter 39-41. Betydelige fremskridt blev opnået med udvikling og forbedring af ekstracellulære multi-kanal optagelse teknikker 42,43. Dette, for eksempel, omfatter udvikling af nye elektroder 44 eller nye spike sortering og klyngedannelse algoritmer 45. Almindelige metoder til ekstracellulære multi-unit optagelse teknikker er velbeskrevne 46-48. De selvstændige bygget elektroderne vist i denne video derudover kan tilpasses ved at tilføje flere microwires pr elektroden eller mikro ledninger kan vrides for at opnå målbare konstante afstande mellem spidserne. Begge procedurer vil dog føre til mindre fleksibilitet og øget tykkelse af elektroden.
I forhold til silicium sonder, der almindeligvis anvendes til ekstracellulære optagelser i meget større insekter som den høg møl, johannesbrødkernemel og kakerlak 40,49 – </sup> 51 de beskrevne mikroorganismer wire elektroder er mindre fleksibel og kan klare let med potentielle hjerne bevægelser og dermed pålideligt kan anvendes i små sociale insekter som bier og myrer, der viser en meget bredere adfærdsrepertoire. De fleste silikone sonder har skarpe skaft lignende strukturer skære axoner og neuralt væv langs deres indsættelse kanal, mens de beskrevne mikro ledninger er runde, fleksibel og mindre og er derfor mindre skadelige for det omgivende væv, hvilket er en klar fordel, hvis målet er at studere lang sigt plasticitet i en intakt og opfører dyr. En anden fordel af mikro trådelektroder er deres lave produktionsomkostninger og nem håndtering. I stedet for omhyggeligt at rense et dyrt silikone sonde elektrodetrådene er frisk skåret før hjernen isætning og mangler derfor problemer med overbelastning. Det er endvidere muligt at anvende mere end én mikro wire elektrode i samme præparat enten indsat i forskellige neuropiles 1 or skrifter 2 som vi viser her. Denne fremgangsmåde er særligt gunstige at analysere og sammenligne tidsmæssige aspekter som respons latenstider og interaktioner på forskellige neurale behandling niveauer.
Vi er klar over, at et ekstracellulært optagede signal ikke afspejler enkelt celle aktivitet per se. Det er altid en forbindelse spænding aktivitet omkring elektroden spids. At lokalisere kilden til signalet forskellen mellem to tilstødende mikro wire kanaler inden en elektrode er altid beregnet. Således kilden til spike signaler, der anvendes til at udvinde enkelt enhed aktivitet var altid meget tæt på enten den ene eller den anden elektrode kanal resulterer i let at skelne spike kurver. Signaler fra længere væk, ligesom muskel aktivitet eller aktivitet af tilstødende neuropils, nå begge elektroder på samme tid fremmane sammenlignelige former og amplituder og vil blive kasseret ved denne procedure. Ved hjælp af skabelonen matching teknik Spike2,Vi er meget overbeviste om at opnå enkelt enhed aktivitet, hvilket ikke er det samme, men meget tæt på enkelt neuron aktivitet. Dog kunne spørgsmålet om spike sortering undgås ved hjælp af intracellulære optagelse teknikker.
Encellede optagelser med enten skarpe elektroder eller patch pipetter tillader tilbundsgående viden om fysiologiske egenskaber for en enkelt neuron. Men på grund af den lille størrelse af insekt neuroner og deres neurites (f.eks. Mindre end 1 um for honningbi PNS 52) kun kortsigtede optagelser er håndterbare. Desuden kan intra cellulære optagelser være invasiv og kan skade den celle, der er muligvis en anden årsag til de tidsmæssige begrænsninger. In vivo intracellulære optagelser i insekter sjældent overleve en time. Et tidsvindue der var tilstrækkeligt for pionerarbejde Martin Hammer 53, der har indspillet intracellulære fra et enkelt identificeret neuron, den ventrale uparrede maxilar neuron # 1 (VUMmx1). Han kunne lblæk dens aktivitet direkte til belønning vej. Juliane Mauelshagen 54 registrerede intracellulært aktiviteten af et identificeret champignon krop extrinsic neuron, den pedunculus ydre neuron # 1 (PE1) under klassisk condition. Det samme neuron var i fokus i Menzel og Manz 55 når de fandt LTP efter elektrisk stimulering af Kenyon Cells. Okada og kolleger 56 kunne imidlertid bruge intracellulært velkarakteriserede spiking mønster (dobbelt og tredobbelt pigge) til identifikation af PE1 under ekstracellulære optagelser. Efter alle en kombination af begge metoder, kan intracellulære optagelser fra identificerede neuroner og ekstracellulære langsigtede optagelser være et effektivt redskab til fremtidige undersøgelser.
Men ved hjælp af skarpe elektroder til at optage flere celler (enheder) samtidigt ved forskellige forarbejdningsmetoder niveauer over mange timer op til dage at analysere deres timelige respons forholdet og / eller endda plastik ændringer, jegs næsten umuligt.
Med den første calcium imaging tilgange i honningbien 57,58 hjælp calcium-følsomme farvestoffer analyse af rumlige mønstre af lugt svar var tilgængelige 59-62. Men i mange tilfælde calciumsensitiv farvestoffer skal blive introduceret til hjernevæv via invasive manipulationer, der igen begrænser biens levetid og iboende egenskaber de analyserede celler. Dette problem er overvundet i andre modelorganismer som bananflue med genetisk indført calcium sensorer 63,64. Men generelt kan calcium sensorer indføre andre begrænsninger, som de kan virke som calcium buffere, der sandsynligvis påvirker den tidsmæssige egenskaber lugt svar. Samtidige intracellulære optagelser kombineret med calcium imaging eller beregningsmæssige metoder kan bevise den rette tidsmæssige opløsning af billeddiagnostik 65,66. Men den tidsmæssige opløsning af den billeddannende proces i sig selv er rather begrænset. Optiske indkøbssystemer normalt bruger CCD-billeddannelse med en tidsmæssig opløsning på 5-20 Hz 67, selv om 2-Photon-Imaging kan være i stand til at erhverve hurtigere sekvenser 68. Men stigende samplingfrekvens altid går sammen med et tab i rumlig opløsning. Endvidere calcium-følsomme farvestoffer, der anvendes i honningbi undergår blegning, hvilket også reducerer akkvisitionstid 69.
Sammenlignet med andre fysiologiske optagelse teknikker i insekter vores fleksible multi-kanal mikro-wire-elektroder sikrer lang tid adgang til én enhed og befolkning neuronal aktivitet i opfører bier.
Vi viste, hvordan at bruge to af disse elektroder på forskellige stadier behandling i det samme dyr, hvilket letter analysen af tidsmæssige kodning aspekter mellem de forskellige optagelse steder. Afhængig af problemstilling og modellen insekt den grundlæggende metode til elektrode bygning demonstreret her er nemt udvidei stand til og / eller kan tilpasses. For eksempel er det tænkeligt at anvende mere end tre enkelte ledninger til at producere multi-kanal elektroder. Desuden kan antallet af optagelse steder forlænges og observere tidsmæssige aspekter af mere end to skrifter eller neuropils er muligt. Vores håb er, at denne metode vil inspirere mange forskere og vil bidrage positivt til forståelsen af sofistikerede neuronal bearbejdning i små hjerner.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.
Paraffin oil | Fluka | 76235 | |
Odors | Sigma Aldrich | ||
PBS | pH 7.2 | ||
4% Formaldehyde | ThermoScientific | 28908 | Methanol free |
Triton X | BioChemica | A1388 | |
Methylsalicylate | Roth | 4529.1 | |
Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby) | Invitrogen | D7162 | keep dark |
Alexa 488 hydrazide | Invitrogen | A-10436 | keep dark |
Alexa 568 hydrazide | Invitrogen | A-10437 | keep dark |
Bee Ringer Solution | see 2 | ||
Polyurethane-coated copper wire | Elektrisola | 15µm diameter & P155 insulation | |
Dental Wax | Densply Detrey | 64103015S1 | moderate melting point |
Dental Wax | Flexaponal | 124-202-00 | low-melting Wax |
KWIK SIl | WPI | 03L | |
18 Pin Socket | Conrad Electronic | 189634-62 | |
Hot melting glue | Conrad Electronic | 827673 | |
soldering needle | Conrad Electronics | 830283 | 12 V |
Soldering terminal lug | Conrad Electronic | 531901 | |
Glaselectrodes | WPI | 1B100F-3 | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | V2A 0.2 x 12 mm |
switchable headstage | Tucer Davis Technologies | SH16 | |
Headstage connection module | NPI | INT-03M | |
Amplifier Module | NPI | PDA-2F | |
Data Acquisition boards | National Instruments | NI-6123, Ni-6143 | |
Acquisition Software | National Instruments | Lab View 8.2 | custom design |
Spike-Sorting | CED | Spike 2 v7.11 | |
Matlab | Mathworks | R2008B | |
Micromanipulator | Leitz | manual | |
AG-wires | WPI | AGT05100 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP2 AOBS | |
AMIRA | Mercury Computer Systems | 2/5/2000 |