التصوير المباشر ل<em> ذبابة الفاكهة</em> اليرقات Neuroblasts

Summary

هذا البروتوكول تفاصيل طريقة مبسطة تستخدم لإجراء التصوير الخلية الحية في سياق الدماغ اليرقات سليمة. النهج التصوير الخلية الحية لا تقدر بثمن لدراسة الخلايا الجذعية العصبية الانقسامات غير المتماثلة فضلا عن العمليات العصبية والتنموية الأخرى، كشف باستمرار الآليات التي تم تجاهلها سابقا.

Abstract

الخلايا الجذعية تقسيم غير متماثلة لتوليد خليتين ذرية غير متكافئة مع إمكانات مصير: الخلايا الجذعية تجديد الذات وخلية التفريق. نظرا أهميتها في التنمية والمرض، وفهم الآليات التي تحكم وكان انقسام الخلايا الجذعية غير المتماثلة منطقة قوية من الدراسة. لأنهم لين العريكة وراثيا والخضوع لجولات متتالية من الانقسام الخلوي عن مرة واحدة كل ساعة، والخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي ذبابة الفاكهة، أو neuroblasts، هي النماذج التي لا غنى عنها لدراسة انقسام الخلايا الجذعية. وتقع على بعد حوالي 100 الخلايا الجذعية العصبية بالقرب من سطح كل من اثنين من فصوص الدماغ اليرقات، مما يجعل هذا النظام نموذجا مفيدا بشكل خاص للدراسات المجهر التصوير الحي. في هذا العمل، نستعرض العديد من الأساليب المستخدمة على نطاق واسع لتصور انقسامات الخلايا الجذعية، ونتناول مزايا وعيوب تلك التقنيات التي توظف فصلها مقابل أنسجة الدماغ سليمة نسبيا. نحن أيضا لدينا simplif التفاصيلبروتوكول العبوات الناسفة المستخدمة لازدراع العقول كلها من يرقات العمر الثالث للتصوير الخلايا الحية والتطبيقات تحليل الثابتة.

Introduction

الخلايا الجذعية الحفاظ على التوازن من التمايز والتجديد الذاتي لتوليد التنوع الخلوية خلال التنمية في وقت مبكر واستبدال الخلايا التالفة في أنسجة البالغين. تنظيم هذا التوازن يمنع كلا من الخسارة والتوسع المفرط للسكان الخلايا الجذعية، التي يمكن أن تؤدي إلى تدهور الأنسجة ضارة أو تكون الأورام.

Neuroblasts (مصلحة الدولة للاحصاء) هي الخلايا الجذعية العصبية درس على نطاق واسع للنظام العصبي المركزي ذبابة الفاكهة (الشكل 1A) أن النموذج الأول خلال المراحل الجنينية ^{1، 2.} مصلحة الدولة للاحصاء الخضوع لدورات متكررة من انقسام الخلايا غير المتماثلة (ACD) لإنتاج خليتين الحظ غير متكافئ: الخلايا الجذعية تجديد الذات وخلية التفريق. ويسترشد ACD بواسطة centrosomes، والعضيات غير الغشائي التي تكون بمثابة مراكز أنيبيب-تنظيم معظم الخلايا ^3. خلال الانقسام، NB centrosomes تنظيم وتوجيه الإنقسامية المغزل بين القطبين على طول القمي، القاعدية القطبيةمحور إيتي. على الانقسام لتقسيم NB، المحددات مصير قمية التي تحدد مصير الخلايا الجذعية، والمحددات التي تحدد مصير القاعدية التمايز، وفصل في الخلايا الوليدة غير متكافئة.

في الدماغ المركزي اليرقات، نوعين من مصلحة الدولة للاحصاء يمكن التمييز بين عددهم، والموقف، عامل النسخ التعبير، والنسب الخلية (الشكل 1A) ^{و 4-6.} النوع الأول مصلحة الدولة للاحصاء هي الأكثر وفرة، وحوالي 90 منهم ملء الجانبين الأمامي والخلفي من كل الفص البصري في الدماغ ^7. هذه مصلحة الدولة للاحصاء التعبير عن عامل النسخ Asense (ASE)، ويتقاسمونها مميز في واحدة NB-تجديد الذات واحد أصغر خلية الأم العقدة (GMC؛ الشكل 1B). كل GMC يخضع لتقسيم محطة واحدة لتوليد الخلايا العصبية أو اثنين الدبقية (الشكل 1B). في المقابل، فإن مصلحة الدولة للاحصاء ثماني النوع الثاني التي تعيش في الجانب الخلفي من كل الفص البصري تفتقر عاصي التعبير ^5. أنها تخضع ACDلإنتاج واحد NB-تجديد الذات واحدة السلف العصبية المتوسطة (الشرطة الوطنية العراقية).

الشرطة الوطنية العراقية، في المقابل، يقسم غير متماثلة 3-5 مرات. كل من هذه النتائج انقسامات في تجديد الشرطة الوطنية العراقية وإنتاج GMC واحدة ^4. بشكل جماعي، وهوية NB محددة وترتيب الزمني للGMC الولادة يؤدي إلى تنوع مذهل من الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي الكبار.

فهم بيولوجيا الخلايا التي ترتكز عليها NB ACD قد تحسنت إلى حد كبير من خلال استخدام تقنيات التصوير الخلية الحية. نشرت البروتوكولات المستخدمة من قبل الباحثين لمصلحة الدولة للاحصاء الصورة الحية تختلف على نطاق واسع. عموما، ومع ذلك، يمكن تجميع هذه الأساليب إلى فئتين عامة تتميز ما إذا كان غادر الدماغ سليمة اليرقات أو ميكانيكيا فصلها. كل التقنيات لها مزايا وعيوب متميزة اعتمادا على التطبيق الباحث.

تقارير مبكرة الكشف عن خلية الحية DIVI NBتنطوي بعض التوترات درجة التفكك دليل من الدماغ اليرقات. هذه البروتوكولات التفاصيل تلطيخ ⁸ أو ⁹ وبصرف النظر إغاظة الدماغ من أجل أن تنمو الثقافات الأولية على المدى القصير من مصلحة الدولة للاحصاء على coverslips الزجاج. لتحسين التصوير، وعادة ما تكون بالارض مصلحة الدولة للاحصاء مستديرة حول لل coverslips مع أي من الشرائح الزجاجية ⁸ أو ⁹ منصات الاغاروز. على الرغم من أن الخلايا بالارض تحسنت البصريات، وهذه التقنيات غالبا ما تؤدي إلى عيوب الإنقسامية NB، بما في ذلك الانحدار من ثلم الانقسام وعدم القدرة على تقسيم أكثر من مرة واحدة. لذلك، عادة ما تكون مناسبة البروتوكولات التي تشمل كلا من التفكك دليل والتشويه الجسدي من أنسجة المخ اليرقات فقط للغاية على المدى القصير (أي.، ودورة خلية واحدة أو أقل) التطبيقات. وبالمثل، وشبه السحق أو تسطيح العقول سليمة تماما بين الشرائح الزجاجية وcoverslips يحد من مرة واحدة قد تنفق التصوير عينة تعطى لفترة حوالي 30 دقيقة ^10. على الرغم من هذا القيد، ثيتم استخدام النهج بنجاح ق ^11-14.

الجهود التي بذلت مؤخرا لصورة حية فصلها مصلحة الدولة للاحصاء حد التشويه الجسدي من الخلايا المعزولة. هذه التقنيات هي مفيدة بشكل خاص للتطبيقات حيث أنه من الضروري للحفاظ على مزارع الخلايا لدورات انقسام الخلايا متعددة. على سبيل المثال، خلايا متناثرة من العقول فصلها يدويا قد تكون جزءا لا يتجزأ جزئيا في جلطة مصنوعة من خليط من الفيبرينوجين وثرومبين ¹⁵ للتصوير على المدى الطويل ^16. بدلا من ذلك، قد تكون العقول explanted أول فصل كيميائيا مع كولاجيناز الانزيم، بجانب تعطل يدويا عن طريق مرور المتكررة من خلال طرف الماصة، ومطلي لاحقا على أطباق أسفل بولي-L-يسين المغلفة الزجاج ^{17 و 18.} طلاء الزجاج مع الأطباق إما الفيبرينوجين أو بولي-L-يسين يعزز المرفق وطفيفة انتشار الخلايا المستديرة، تقديمهم أقرب إلى ساترة ممكن دون تحريف المادية الكبرى. في additiعلى، وهذه الأساليب تشمل زراعة مصلحة الدولة للاحصاء في المتوسطة التي قد يتم تبادلها بسهولة لتجارب اضطراب الدوائية ^18. عموما، والطلاء مباشرة فرقت مصلحة الدولة للاحصاء يحسن البصريات التصوير دون التضحية قدرات التصوير على المدى الطويل. في الآونة الأخيرة، وبروتوكول اصفا زراعة على المدى الطويل من مصلحة الدولة للاحصاء تم فصلها تفصيلا ^19.

ومع ذلك، فإن هذا النهج لا يخلو من حدوده. وهناك العديد من المحاذير لمصلحة الدولة للاحصاء التصوير فصلها الحية. في مجال خلايا متناثرة، على سبيل المثال، فإنه من الصعب تحديد الأنساب NB محددة مكانيا التي يتم تنظيمها في الدماغ سليمة ^1. وبالمثل، التمييز بين النوع الأول النوع الثاني مقابل مصلحة الدولة للاحصاء داخل الأنسجة فصلها هو أيضا تحديا دون التعبير عن استشفاف النسب أو الجينات المحورة سلالة محددة، مثل worniu-GAL4، asense-GAL80 ^20. على الرغم من أن هذه الجينات المحورة هي مفيدة جدا لبعض التطبيقات، فإنها لا تحد من الباحثين من تلك الجينات المحورة السابقينضغطت تحت سيطرة العنصر UAS محسن ²¹ وتتطلب خطط الجينية أكثر تعقيدا. الدراسات التي تهم التنمية المكانية أو الزمانية من مصلحة الدولة للاحصاء، وبالتالي، يتطلب التصوير في الجسم الحي في سياق الأنسجة سليمة.

علاوة على ذلك، من مصلحة الدولة للاحصاء الدراسات الجنينية فصلها تشير إلى أن الاتصال الجسدي من الخلايا المجاورة هو أمر حاسم لتوطين البيني من الأقطاب الرئيسية محددات ^{22، 23.} تظهر هذه الدراسات معزولة تماما مصلحة الدولة للاحصاء لم يعد الحفاظ على محور المغزل الإنقسامية ثابتة. بدلا من ذلك، وعرض هذه الخلايا محور المغزل أكثر عشوائية وزوايا واسعة من الفصل بين براعم GMC المتعاقبة، وربما يرجع ذلك إلى فقدان قمية المواقع الجسيم المركزي ^22. على الرغم من أن العلاقة بين مصلحة الدولة للاحصاء اليرقات والخلايا المجاورة لها لم تدرس على نطاق واسع، فإنه يجدر النظر أن اليرقات المكروية الخلايا الجذعية قد تؤثر على قطبية الخلية أو غيرهاالسلوكيات. للحفاظ على السياق الفسيولوجية للاليرقات مصلحة الدولة للاحصاء، ونحن ACD صورة من العقول كلها.

بالنظر إلى القيود المتأصلة المرتبطة التصوير فصلها مصلحة الدولة للاحصاء، وضعت لدينا مختبر وغيرها بروتوكولات لصورة جولات متعاقبة من NB ACD من العقول اليرقات كله. تقنيات لصورة أدمغة سليمة في كثير من الأحيان استبدال سطح جامدة من الزجاج على جانب واحد من الغرفة الثقافة مع غشاء مرن لمنع تشويه الأنسجة أو ضرر والسماح لتبادل الغازات. تنطوي على بعض الأساليب تصاعد العقول explanted في خليط من الحشرات متوسطة زراعة، ومصل، وحمض الأسكوربيك مع الهيئات الدهون معزولة عن اليرقات عشرة ^24. تضاف الهيئات الدهون معزولة لأنها تفرز mitogen المعروف لتحفيز انقسام الخلايا NB ^25. هذا البروتوكول يحافظ على سلامة الأنسجة لأكثر من 3 ساعة، وبالتالي، قابلة للتصوير طويلة الأجل ^{24، 26-28.} في الآونة الأخيرة، وبروتوكول يصف خط الطولالتصوير ز الأجل من أدمغة يرقات سليمة في وجود حمض الأسكوربيك، ومصل، والهيئات الدهون وردت تفاصيلها ^29. الأهم من ذلك، لأن الأنسجة لا يتم كشفها ولا يجمد، وهذا النهج هو أقل فائدة للتطبيقات حيث يتم تبادل زراعة المتوسطة (على سبيل المثال، ودراسات المخدرات، immunodepletion، الخ).

لدينا مختبر وتبسيط إعداد جبل كامل من العقول اليرقات الحية للتصوير طويلة الأجل ^{30، 31.} والميزة الرئيسية لبروتوكول لدينا مقارنة مع الآخرين هو بساطته: ملاحظاتنا تشير لا مصل، حمض الأسكوربيك، الانسولين، ولا الأجسام الدهنية المضافة هي ضرورية لصورة جولات متعاقبة من NB ACD. على الرغم من أن المواد المضافة، مثل الانسولين، وكانت مفيدة للتصوير لفترات طويلة من الانقسامات الخلايا الجذعية والهجرة الجماعية ³² خلية في المبايض ذبابة الفاكهة ^33، ويبدو أن الاستغناء عن NB ACD، كما يتكون لدينا المتوسطة التصوير من خليط بسيط من ستاndard الحشرات المتوسطة زراعة الخلايا تستكمل مع مضاد فطري للمضادات الحيوية لمنع التلوث. من خلال استخدام الأطباق ثقافة أسفل الغاز قابلة للاختراق أو الزجاج قابلة لإعادة الاستخدام، وكنا قادرين على الحفاظ على عدة جولات من المتعاقبة NB ACDs. يمكن بسهولة العينات explanted نفسه استخدامها لالمناعي وغيرها من الإجراءات مع الأنسجة الثابتة. في هذا البروتوكول، ونحن من التفصيل تشريح أدمغة يرقات سليمة، فضلا عن إعداد العقول لتحليل كل من الحية والثابتة.

Protocol

1. إعداد المواد المطلوبة لازدراع الأمخاخ الثالث الطور اليرقات وتعد الأدوات اللازمة لتسليخ مجهري. إقامة أداتين تشريح (مشرط وهوك) عن طريق وضع دبوس تشريح أول واحد في كل حام…

Representative Results

وقد أوضحت التصوير الحي عددا من الآليات التي تنظم NB ACD. قبل الحصول على الصور، فمن الضروري لتحديد ظروف التصوير المثلى. فمن الضروري لتحقيق التوازن في معدل التقاط الإطار مع مدة التصوير الخلية الحية. لتحليل الخلوية الجميلة، على سبيل المثال، زيادة الزمانية وربما تكون هناك …

Discussion

التصوير الخلية الحية هو نهج لا تقدر بثمن تستخدم لدراسة الآليات التي تنظم ACD من الخلايا الجذعية، وتمايز الخلايا الأنساب، والتشكل من أنسجة معقدة. على الرغم من أن المجموعات البحثية قد استخدمت تاريخيا مجموعة متنوعة من التقنيات لتصور NB ACD، هذه النهج يمكن تصنيفها بصفة عام?…

Materials

Lumox Tissue Culture Dish 50X12 mm	Sarstedt	94.6077.410	A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.
Schneider's S2 Medium	Invitrogen	21720-024
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)	Invitrogen	15240-062	A supplement containing penicillin (10,000 U/mL), streptomycin (10,000 mg/mL), and amphotericin B (25 mg/mL) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.
Glass coverslips, #1.5 22X22 mm	Fisher Scientific	12-541-B
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898	A high viscosity inert oil that is clear and colorless.
pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long	Fine Science Tools	26018-17
Minutien dissecting pins	Fine Science Tools	26002-10
pair of Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Dissecting needle/probe with plastic handle	Fisher Scientific	08-965-A
Syringe filter, 0.22 mm pore size	Fisher Scientific	09-719A
Syringe 5 mL	BD Biosciences	309646
plastic transfer pipet	Fisher Scientific	S30467-1
paraformaldehyde, 32% EM-grade	Electron Microscopy Sciences	15714	CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	A dye that labels DNA and is excited by UV light.
Aqua/PolyMount; Polysciences, Inc.	Fisher Scientific	18606-20	A water-soluble mounting medium.