Um Guia para In vivo Gravação única unidade de Optogenetically Identificado Cortical Inibitória Interneurônios

Resumo

Aqui descrevemos nossa estratégia para obter gravações de unidade única estáveis e bem isoladas de interneurônios inibitórios identificados no córtex de camundongo anestesiado. Os neurônios que expressam ChR2 são identificados por sua resposta à luz azul. O método usa equipamento de gravação extracelular padrão e serve como uma alternativa barata à imagem de cálcio ou patch guiado visualmente.

Resumo

Um grande desafio em neurofisiologia tem sido a de caracterizar as propriedades de resposta e função dos inúmeros tipos de células inibitória no córtex cerebral. Nós aqui partilhar a nossa estratégia para a obtenção estáveis, bem isoladas gravações de uma única unidade de interneurônios inibitórios identificadas no córtex anestesiado mouse usando um método desenvolvido por Lima e colaboradores ^um. As gravações são realizadas em ratinhos que expressam channelrodopsina-2 (ChR2) em subpopulações neuronais específicas. Os membros da população são identificados pela sua resposta a um breve flash de luz azul. Esta técnica - chamada de "PINP", ou Identificação fotoestimulação-assistida de Populações Neuronais - pode ser implementado com equipamento de gravação extracelular padrão. Ela pode servir como uma alternativa barata e acessível a imagiologia de cálcio ou patching visualmente-guiado, com o objectivo de direccionamento gravações extracelulares de células identificadas geneticamente. Here nós fornecemos um conjunto de diretrizes para a otimização do método na prática diária. Nós refinado nossa estratégia especificamente para alvejar as células parvalbumina-positivo (PV +), mas descobriram que ele funciona para outros tipos interneuron, bem como, tais como (CR +) interneurons expressando Calretinin-somatostatina expressando (SOM +) e.

Introdução

Caracterizar a miríade de tipos de células que compõem o cérebro dos mamíferos tem sido um objetivo central, mas há muito indescritível, da neurofisiologia. Por exemplo, as propriedades e funções de diferentes tipos de células inibitórias no córtex cerebral são tópicos de grande interesse, mas ainda são relativamente desconhecidos. Isso ocorre em parte porque as técnicas convencionais de gravação in vivo cegas são limitadas em sua capacidade de distinguir entre diferentes tipos de células. A largura do pico extracelular pode ser usada para separar neurônios inibitórios positivos para parvalbumina de células piramidais excitatórias, mas esse método está sujeit....

Protocolo

NOTA: O seguinte protocolo está de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde como diretrizes aprovados pela Universidade de Oregon Animal Care e do Comitê Use.

1. Cirurgia aguda

1. Anestesiar o animal com um cocktail de cetamina-medetomidina, via intraperitoneal (ip) (Tabela 1).
   NOTA: Os ratos usados ​​nestas experiências são gerados pelo cruzamento de um ChR2-EYFP line10 transgénico dependente de cre a Interneuron linhas de driver (Pvalb-iCre11, PV +; Sst-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +). Entrega Viral de ChR2 ou opsinas relacionados devem funcionar igualmente bem, assumindo níveis de expressão semelhante....

Resultados

Nós aqui partilhar a nossa estratégia para a obtenção de gravações de uma única unidade de interneurônios inibitórios geneticamente classificados no córtex anestesiado rato, utilizando um método optogenetic desenvolvido por Lima et al. A Tabela 1 detalha o cocktail anestésico sugerido, quetamina-medetomidina-acepromazina ⁽¹ ". KMA "). A Figura 1 representa um microeléctrodo de tungsténio, preparado para a gravação. A figura 2 contém um diagrama de ci.......

Discussão

Embora PINP é conceitualmente simples, ele pode ser um desafio na prática. Um dos principais determinantes do sucesso é a escolha do eletrodo. O raio de audição eléctrica é o parâmetro crítico. Ele deve ser suficientemente grande para detectar picos de luz evocado quando a ponta é ainda a certa distância a partir de uma célula ChR2 +, de modo que se pode ajustar a velocidade de avanço em conformidade. Ao mesmo tempo, deve ser restringido o suficiente para permitir um bom isolamento única unidade. Ou seja, o eletrodo não.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linha ChR2-EYFP	Colônias Jackson	12569
Linha Pvalb-iCre (PV) Colônias	Jackson	8069
Linha Sst-iCre (SOM) Colônias	Jackson	13044
Linha Cr-iCre (CR)	Colônias Jackson	10774
Agarose	Sigma-Aldrich	A9793	Tipo III-A, Alto EEO
Micro Point (dural gancho)	FST	10066-15
Tesoura Cirúrgica	FST	14084-09
Bisturi	FST	10003-12 (alça), 10011-00 (lâminas)
Pomada Oftálmica Puralube	Foster & Manta	9N-76855
	Aparelho Harvard	507220F
Tungsten Microelectrodes	A-M Systems	577200	12 MΩ Resistência AC, 127 μ m de diâmetro, 12° ponta cônica, Tubo de Vidro Capilar Revestido com Epóxi
	Warner Instruments	G150TF-3
Tubo Termo Retrátil	DigiKey	A332B-4-ND
Acelerador Zapit	DVA	SKU ZA/ZAA	Use com Super Cola padrão.
Amplificador AC de Microeletrodo 1800	AM Systems	700000
MP-285 Micromanipulador Motorizado	Sutter	MP-285
Osciloscópios Digitais de 4 canais	Alto-falantes Alimentados	por TDS2000C
		Modelo Harman JBL  Manipulador Manual Duet
	Scientifica	LBM-7
800 µ m Cabo de remendo de fibra óptica	ThorLabs	FC/PC BFL37-800
Medidor de potência	ThorLabs	PM100D (medidor de energia), S121C (sensor de potência padrão)
475 nm Cree XLamp XP-E	DigiKey	XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND	A potência e a eficiência do LED estão aumentando continuamente, por isso recomendamos verificar os produtos mais recentes (www.cree.com).
Arduino UNO	DigiKey	1050-1024-ND

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