عالية الإنتاجية الفحص إلى النمط الظاهري<em> السالمونيلا الملهبة لل</em> جمعية التيفية الفأرية، والغزو، والنسخ المتماثل في الضامة
Summary
وتم إعداد مقايسة الإنتاجية العالية لفي المختبر النمط الظاهري السالمونيلا أو جمعية البكتيرية الأخرى، والغزو، وتكرارها في الخلايا البلعمية مع القدرة الإنتاجية العالية. وقد استخدمت طريقة لتقييم السالمونيلا خروج المغلوب الجينات سلالات متحولة للتدخلات في التفاعلات المضيف الممرض.
Abstract
أنواع السالمونيلا ومسببات الأمراض الحيوانية المنشأ والأسباب الرئيسية للأمراض التي تنقلها الأغذية في البشر والماشية 1. فهم الآليات الكامنة وراء التفاعلات السالمونيلا -host تعتبر مهمة لتوضيح المرضية الجزيئي للعدوى السالمونيلا. حماية فحص جنتاميسين إلى النمط الظاهري جمعية السالمونيلا، والغزو وتكرارها في الخلايا البلعمية تم تكييفها للسماح الفرز الفائق الإنتاجية لتحديد أدوار المسوخ حذف السالمونيلا التيفية الفأرية الملهبة للالمصلي في التفاعلات المضيف باستخدام RAW 264.7 الضامة الفئران. بموجب هذا البروتوكول، التباين في القياسات وانخفاض كبير مقارنة مع بروتوكول قياسي، لأنه من النوع البري وسلالات متحولة متعددة يمكن اختبارها في صحن الثقافة ونفس في نفس الوقت. استخدام ماصات متعددة يزيد من الإنتاجية ويحسن الدقة. وعلاوة على ذلك، المخاوف المتعلقة باستخدام أقل حوتمت معالجة خلايا الحادي لكل بئر في صحن الثقافة 96 أيضا. هنا، كان يعمل بروتوكول لتعديل في المختبر باستخدام فحص السالمونيلا غزو الخلايا البلعمية بنجاح إلى النمط الظاهري 38 الفردية المسوخ السالمونيلا الحذف للجمعية، والغزو والتكرار داخل الخلايا. يتم عرض الظواهر في المختبر، وقد أكد بعض منها في وقت لاحق أن يكون في الظواهر الحية في نموذج حيواني. وهكذا، فإن تعديل، فحص موحد لجمعية النمط الظاهري السالمونيلا، والغزو وتكرارها في الضامة يمكن استخدامها مع القدرة الإنتاجية العالية على نطاق أوسع لدراسة التفاعلات البكتيرية المضيفة.
Introduction
Nontyphoidal السالمونيلا هي الأسباب الهامة للأمراض المعوية في جميع الفقاريات. السالمونيلا في البشر هو من بين أكبر الأمراض التي تنقلها الأغذية البكتيرية 1. ويتحقق توصيف الآليات الجزيئية التي تدعم تفاعلات السالمونيلا مع المضيفين الحيوان بشكل رئيسي من خلال دراسة السالمونيلا التيفية الفأرية الملهبة للالمصلي (STM) في نماذج زراعة الأنسجة الحيوانية والعدوى. سوف اكتساب رؤى في التفاعلات STM-المضيف تساعدنا على فهم كيفية السالمونيلا البقاء والنمو داخل الخلايا المضيفة. التحدي الأول في دراسة هذه التفاعلات هو تحديد العديد من العوامل المشاركة ممكن من كل من المضيف والممرض، ولكن يتم عرقلة هذه المساعي إلى حد كبير من قبل صعوبات كبيرة في التعامل مع اثنين من النظم البيولوجية المعقدة المستقلة في وقت واحد، أي المضيف والسالمونيلا، تحت الظروف الفسيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، repert كبيرoire من السالمونيلا والجينات المضيف المحتمل ترميز العوامل التي تدخل في التفاعلات البيولوجية المضيفة تتطلب منصة عالية الإنتاجية لمواجهة هذا التحدي.
وتعديل، فحص موحد لجمعية النمط الظاهري السالمونيلا، والغزو وتكرارها في الضامة مع القدرة الإنتاجية العالية وضعت لدراسة مجموعة كبيرة من الجينات المرجح الانخراط في التفاعلات السالمونيلا -host. وقد وضعت حماية فحص جنتاميسين في عام 1973 2، ولكن لأول مرة وصف دقيق من قبل Elsinghorst في عام 1994 3،4. أصبح الآن هو أداة موحدة لدراسة العديد من مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا خارج الجسم، بما في ذلك السالمونيلا 5،6. تجنب البكتيريا المنضوية التعرض للقتل من قبل بعض المضادات الحيوية، مثل جنتاميسين، التي لا يمكن ان تخترق الخلايا حقيقية النواة 3. من خلال الاستفادة من هذه الظاهرة، وحماية جنتاميسين فحص يقيس بقاء ونمو الخلايا باcterial مسببات الأمراض. ثلاثة أحداث أثناء العدوى، أي ارتباط مع الخلايا حقيقية النواة، والغزو والتكرار، يمكن تقييم لمسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا استنادا إلى الفاصل الزمني بين الإصابة والعلاج جنتاميسين، ومزيد من الحضانة (الشكل 1). خطوط الخلايا حقيقية النواة توفر بيئة الفسيولوجية التي هي أقل تعقيدا من النماذج الحيوانية ذات الصلة للدراسات التفاعل المضيف الممرض.
حماية فحص جنتاميسين هو منصة مناسبة لدراسة التفاعلات STM-المضيف، ولكن الفحص القياسية في صحن الثقافة 24 جيدا لديه قدرة منخفضة الإنتاجية. وحدد التحليل الحسابي في الجسم الحي من مجموعات البيانات 149 منتجات السالمونيلا الجين الذي من المتوقع أن تتفاعل مع ما يقرب من 300 منتج الجين المضيف (بيانات غير منشورة). ليس لديها معيار جنتاميسين الحماية فحص القدرة على النمط الظاهري هذا العدد من المسوخ بكفاءة.
في additأيون، وحماية فحص جنتاميسين يمكن كشف نظريا غزو حتى بكتيريا واحد. بسبب هذه الحساسية المتأصلة، البيانات الخام عرضة للالفروق الفنية عندما كرر في أوقات مختلفة. الضوابط الداخلية وعرض البيانات النسبي بعد تطبيع ضرورية لتفسير مغزى النتائج. ونظرا لهذه الاعتبارات، تم وضع تعديل، موحد جنتاميسين الحماية فحص لتعزيز قدرة الاختبار وزيادة الدقة.
بروتوكول التالية هي مفصلة وموضحة لإجراء تعديل مقايسة حماية الجنتاميسين باستخدام أطباق ثقافة 96 جيدا والبلاعم RAW264.7 خط الخلية الفئران. مقارنة بروتوكول قياسي في أطباق ثقافة 24 جيدا، وبروتوكول تعديل والمزايا التالية: 1) عن طريق أطباق ثقافة 96 جيد يسمح ما يصل الى 10 سلالات متحولة مختلفة ليتم phenotyped بما في ذلك الضوابط الإيجابية والسلبية الداخلية مع قوة إحصائية كافية.2) يتم تخفيض التباين في النتائج بشكل كبير، لأنه يتم اختبار سلالات متحولة في صحن الثقافة نفسها وفي نفس الوقت؛ 3) استخدام ماصات متعددة القنوات يزيد الإنتاجية مع تقليل عامل التعب. وأخيرا، مقارنة مع 24 أطباق ثقافة جيدا، والتعامل مع مخاوف من خلايا أقل المضيفة لكل بئر في صحن الثقافة 96 جيدا من خلال تحسين وتوحيد بروتوكول.
وباختصار، فإن تعديل، فحص موحد لفي المختبر النمط الظاهري السالمونيلا أو جمعية البكتيرية الأخرى، والغزو وتكرارها في الخلايا البلعمية يزيد الدقة ويحقق القدرة الإنتاجية العالية مع خفض عامل التعب.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم استخدام الحماية فحص جنتاميسين على نطاق واسع لدراسة الغزو وتكرار مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا داخل الخلية المضيفة، ومن خصوصا أداة البيولوجية الهامة لدراسة مسببات الأمراض مثل السالمونيلا، التي الغزو هي الخطوة شرطا مسبقا لإقامة العدوى 1. يتم تط…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد أيد هذا المشروع جزئيا من خلال منحة للمعاهد الوطنية للصحة NIAID (لAJB وLGA، R01 AI076246). وأيد جمع متحولة السالمونيلا جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح (لMM، U01 A152237-05، AI07397-01 R01، R01 R01 AI039557-11 وAI075093-01)، وذلك جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح (لHAP، R21 AI083964-01، 1R0 1AI083646-01، 1R56AI077645، R01 AI075093). نشكر ستيفن Prowollik لطلاء طبق الأصل، والتأكيد على المسوخ في المجموعة.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 cell culture flask vented filter cap | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100X Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353086 | |
| 96-well cell culture plate | Corning Incorporated | 3595 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH7.4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Kanamycin solution | Sigma | K0254 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 |
Referências
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).
- Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).
- Behlau, I., Miller, S. I. A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells. J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).
- Hueck, C. J., et al. Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins. Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).
- Steele-Mortimer, O. Infection of epithelial cells with Salmonella enterica. Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).
- Foster, J. W., Spector, M. P. How Salmonella survive against the odds. Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).
- Molinari, G., et al. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium. Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).
- Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).
- Lawhon, S. D., et al. Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach. PLoS One. 6, e26869 (2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion. Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).
