Высокая пропускная Анализ фенотипу<em> Salmonella enterica</em> Typhimurium Ассоциация, Нашествие, и репликации в макрофагах
Summary
Была разработана с высокой пропускной анализ, чтобы в пробирке фенотипа сальмонеллами или другой бактериальной ассоциации, вторжения и репликации в фагоцитов с высокой пропускной способностью. Метод был использован для оценки Salmonella ген нокаут мутантных штаммов для их вовлеченности в хозяин-патоген взаимодействий.
Abstract
Salmonella виды патогенов и ведущими причинами продуктами болезней у людей и скота 1. Понимание механизмов, лежащих в основе сальмонеллы -host взаимодействия важны для выяснения молекулярного патогенеза сальмонеллеза. Анализ защиты гентамицин фенотипу Salmonella ассоциации, вторжение и репликации в фагоцитирующих клеток был адаптирован, чтобы позволить высокой скрининг для определения роли мутантов с делецией Salmonella enterica серотипа Typhimurium в принимающих взаимодействий с использованием RAW 264,7 мышиных макрофагов. Согласно этому протоколу, дисперсию измерений существенно снижается по сравнению со стандартным протоколом, так как дикого типа, и множество мутантные штаммы могут быть проверены в той же культуральной чашке, и в то же время. Использование многоканальных пипеток увеличивает пропускную способность и повышает точность. Кроме того, опасения в связи с использованием менее хоул клеток на лунку в культуральной чашке 96-а были адресованы. Вот, протокол модифицированного пробирке Salmonella вторжения анализа при помощи фагоцитоза клетки был успешно применен для фенотип 38 индивидуальных Salmonella делеционных мутантов для объединения, вторжения и внутриклеточной репликации. В фенотипы в пробирке представлены, некоторые из которых впоследствии были подтверждены, чтобы иметь в естественных фенотипов в животной модели. Таким образом, изменение, стандартные тесты на фенотип Salmonella ассоциации, вторжение и репликации в макрофагах с высокой пропускной мощности могут быть использованы в более широком смысле для изучения бактериально-хост взаимодействий.
Introduction
Nontyphoidal Salmonella являются важными причинами кишечных заболеваний у всех позвоночных. Сальмонеллез у человека является одним из главных бактериальных болезней пищевого происхождения 1. Характеристика молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия Salmonella со своими хозяевами животных в основном достигается через изучение Salmonella enterica серотипа Typhimurium (СТМ) в культуре ткани и животных моделях инфекции. Получение понимание в STM-хост взаимодействий поможет нам понять, как Salmonella выжить и развиваться внутри клеток-хозяев. Первая задача в изучении этих взаимодействий является определить, как много участвующих факторов, а от хозяина и патогена, но эти усилия в значительной степени препятствуют значительные трудности дело с двумя независимыми сложных биологических систем одновременно, то есть, хост и сальмонеллы, при физиологических условиях. Кроме того, большое Repertoire сальмонеллы и гены хозяина потенциально кодирующие факторы, участвующие в принимающих взаимодействий требуют высокой пропускной биологическую платформу для решения этой проблемы.
Изменение, стандартные тесты на фенотип Salmonella ассоциации, вторжение и репликации в макрофагах с высокой пропускной способностью был разработан для изучения большой набор генов, вероятно, занимающихся Salmonella -host взаимодействий. Анализ защиты гентамицин был разработан в 1973 году 2, но впервые была тщательно описывается Elsinghorst в 1994 3,4. Теперь это стало стандартным инструментом для изучения многих внутриклеточных бактериальных патогенов экс естественных условиях, в том числе сальмонеллы 5,6. Интернализованная бактерии избегают гибели от некоторых антибиотиков, таких как гентамицин, что не могут проникнуть эукариотических клеток 3. Воспользовавшись этим явлением, анализ защиты гентамицин измеряет выживания и роста внутриклеточных баcterial патогены. Три события в период инфекции, т.е. связь с эукариотических клеток, инвазии и репликации, может быть оценена для внутриклеточных бактериальных патогенов на основе временного интервала между инфекции, лечения гентамицин, и дальнейшей инкубации (рисунок 1). Эукариотической клетки линии обеспечивают физиологическую среду, которая является менее сложным, чем соответствующих животных моделях для исследования взаимодействия хост-патогена.
Защита анализа Гентамицин является подходящей платформой для изучения СТМ-хост взаимодействий, но стандарт анализа в культуральной чашке 24-луночного имеет низкую пропускную способность. Автоматическая обработка естественных условиях наборов данных в идентифицированы 149 генов сальмонеллы продукты, которые, по прогнозам, взаимодействовать с приблизительно 300 генов хозяина продукции (неопубликованные данные). Стандарт гентамицин анализ защиты не имеют возможности фенотип это число мутантов эффективно.
В Additионный, анализ защиты гентамицин теоретически может обнаружить вторжение даже одной бактерии. Из этой присущей чувствительности, необработанные данные восприимчивы к техническим дисперсий, когда повторяется в разные моменты времени. Внутренние органы управления и относительная представление данных после нормализации имеют важное значение для содержательной интерпретации результатов. Учитывая эти соображения, изменение, стандартизированная гентамицин защиты был разработан анализ, чтобы добавлять потенциала по тестированию и повышают точность.
Следующий протокол подробно и показано для выполнения измененного гентамицина защиты анализа, используя блюда культуры 96-а и мышиный линию макрофагов RAW264.7 клеток. По сравнению со стандартным протоколом в чашки для культивирования с 24 лунками, модифицированный протокол имеет следующие преимущества: 1) Использование тарелки культуры 96-а позволяет до 10 различных мутантных штаммов, которые будут phenotyped в том числе внутренних положительных и отрицательных контролей с достаточной статистической мощности;2) Дисперсия результатов значительно снижается, потому что мутантные штаммы тестируют в той же культуральной чашке, и в то же время; 3) Использование многоканальных пипеток увеличивает пропускную при одновременном снижении утомляемости оператора. Наконец, по сравнению с блюдами культуры 24-а, опасения менее клетках-хозяевах на лунку в культуральной чашке 96-а были адресованы путем оптимизации протокола и стандартизации.
Таким образом, изменение, стандартные тесты, чтобы в пробирке фенотипа Salmonella или другой бактериальной ассоциации, инвазию и репликации в фагоцитирующих клеток повышает точность и достигает высокой пропускной способности при одновременном снижении усталости оператора.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ защиты Гентамицин широко используется для изучения вторжение и репликации внутриклеточных бактериальных патогенов внутри клетки-хозяина, и это особенно важным биологическим инструментом для изучения патогенов, как сальмонелла, чьи вторжение является предпосылкой шаг д?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был поддержан частично грантом на Национальных Институтов здравоохранения NIAID (для AJB и LGA, R01 AI076246). Мутант коллекция Salmonella была частично поддержана Национальными Институтами грантов здравоохранения (для ММ, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 AI039557-11 и R01 AI075093-01), частично Национальными Институтами грантов здравоохранения (для ГАП, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Мы благодарим Штеффен Prowollik для реплик и подтверждения мутантов в коллекции.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 cell culture flask vented filter cap | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100X Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353086 | |
| 96-well cell culture plate | Corning Incorporated | 3595 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH7.4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Kanamycin solution | Sigma | K0254 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 |
Referências
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).
- Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).
- Behlau, I., Miller, S. I. A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells. J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).
- Hueck, C. J., et al. Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins. Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).
- Steele-Mortimer, O. Infection of epithelial cells with Salmonella enterica. Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).
- Foster, J. W., Spector, M. P. How Salmonella survive against the odds. Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).
- Molinari, G., et al. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium. Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).
- Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).
- Lawhon, S. D., et al. Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach. PLoS One. 6, e26869 (2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion. Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).
