Modelado astrocitoma Patogénesis<em> In Vitro</em> Y<em> En Vivo</em> Uso cortical astrocitos o células troncales nerviosas de ratones condicionales, Genéticamente Manipulados

Summary

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Abstract

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Introduction

Los astrocitomas son el tumor cerebral primario más común y glioblastoma (GBM), un astrocitoma de grado IV, es el subtipo más común y agresiva con una supervivencia media de 12 a 15 meses ^1,2. La invasión de los astrocitomas difusos, en particular GBM, se opone a la resección quirúrgica completa, limita la eficacia de las terapias adyuvantes, y conduce inevitablemente a la recurrencia después del tratamiento ^3. Los pacientes inicialmente presentes ya sea de novo (primaria) GBM o con astrocitomas de grado bajo que progresa inevitablemente a GBM (secundaria) ^4. GBM es genómicamente heterogénea y que se caracteriza por mutaciones mutuamente excluyentes y concurrentes en los genes que gobiernan tres principales vías de señalización: el punto de control del ciclo celular _G1 / S (Rb), receptor de la tirosina quinasa (RTK), y TP53 vías ^5-7. GBM consiste en cuatro subtipos genómicos con distintos perfiles de expresión que se asemejan a los diferentes tipos de células del cerebro, lo que sugiere que el subtipo de GBM es influmentado por su ^6,8,9 célula de origen. Se requieren mejores modelos de astrocitoma para definir el papel de las combinaciones específicas de mutaciones en tipos particulares de células durante la patogénesis astrocitoma. Aprovechando estos modelos para el desarrollo preclínico más eficiente de drogas en última instancia, ayudará a mejorar los resultados del paciente. Modelos actuales incluyen astrocitoma establecieron líneas celulares humanas, paciente derivado xenoinjertos (PDX), astrocitos humanos normales modificados genéticamente y las células madre neurales (NSC), y ratones modificados genéticamente (GEM) ^10-14. Hemos desarrollado un modelo alternativo, GEM no germinal (nGEM) ¹⁵ utilizando células cerebrales primarios – astrocitos corticales y NSC – cosechadas de GEM que alberga varias combinaciones de alelos oncogénicos floxed. El objetivo era generar modelos de astrocitoma con células genéticamente definidos que podrían ser caracterizadas fenotípicamente tanto in vitro como in vivo y potencialmente utilizados para el desarrollo de fármacos preclínica en iratones mmune-competentes.

Líneas celulares humanas establecidas son el modelo más comúnmente usado de la patogénesis astrocitoma y la respuesta al fármaco in vitro e in vivo. Son técnicamente sencillo, ampliamente disponibles, y han definido cinética y la tumorigenicidad sobre xenoinjertos ortotópico en ratones inmunodeficientes ^10,11,16-18 . Sus desventajas incluyen la incapacidad para generar líneas celulares establecidas a partir de los astrocitomas de bajo grado, limitando estudio sólo a los astrocitomas de alto grado; falta de una celda definida de origen; la presencia de anormalidades genómicas complejas, a menudo con perfiles genómicos que difieren notablemente de la muestra original paciente; y la susceptibilidad a fenotípica y genotípica de deriva durante el cultivo en serie en el suero ^11,17,19-22. Las consecuencias fenotípicas de las mutaciones oncogénicas individuales en líneas celulares de GBM humanos establecidos pueden ser enmascarados por la multitud de anomalías que están realmente presentes, que a menudo impide elucconso- de consecuencias directas genotipo-fenotipo.

PDX se generan a través del paso subcutánea de células de astrocitoma aislados de pacientes en ratones inmunodeficientes o por medio de su cultura como esferoides no adherentes en, medio definido libre de suero antes de la inyección ortotópico en el cerebro de ratones inmunodeficientes ^12,23. PDX mantener con más precisión el paisaje genómico de astrocitomas humanos, pero similar a líneas celulares humanas establecidas, el efecto fenotípico de mutaciones oncogénicas individuales se puede enmascarar debido a su complejidad genómica ^19,24. Para definir las consecuencias fenotípicas de las mutaciones oncogénicas específicas, particularmente en respuesta a las nuevas terapias, los paneles de líneas celulares humanas establecidas o PDX se utilizan con frecuencia para establecer correlaciones genotipo-fenotipo, mostrar generalización, y reducir al mínimo la probabilidad de efectos específicos de la línea de células. Mientras PDX recapitular con precisión las características histopatológicas de astrocitomas humanos, incLuding invasión, xenoinjertos ortotópico de líneas celulares humanas establecidas generalmente no ^21,23,25. Además, los astrocitos humanos normales y NSC-han sido modificadas genéticamente con mutaciones oncogénicas definidos para modelar la tumorigénesis astrocitoma in vitro e in vivo ^13,14,26. Estas células carecen de la complejidad genómica de líneas celulares humanas establecidas y PDX y recapitulan precisión histopatología astrocitoma humano, pero requieren xenoinjerto en roedores inmunodeficientes in vivo. Debido a que todos los modelos celulares humanas requieren huéspedes roedores inmunodeficientes para prevenir el rechazo de xenoinjerto inmune mediada, estos modelos fallan para recapitular las interacciones nativas tumor-estroma de un sistema singénico y carecen de un sistema inmunológico intacto, lo que limita la investigación preclínica de estroma-dirigida y inmune moduladora terapias ^10,11.

GEM permiso de examen de las consecuencias fenotípicas de combinaciones predeterminadas de muta oncogénicociones in vivo durante situ en la tumorigénesis. Considerando que el GEM no condicional tienen mutaciones en todos los tejidos de todo el desarrollo, GEM condicional han floxed alelos oncogénicos que permiten la orientación de las mutaciones mediante la restricción de la recombinación mediada por Cre a determinados tipos de células a través del uso de tipos específicos de promotores celulares ^10,11,15,18. GEM astrocitoma condicional se han utilizado para elucidar el papel funcional de mutaciones oncogénicas en distintos tipos de células dentro de un cerebro intacto ^11. La utilidad preclínica de gliomagénesis en situ usando GEM condicional está limitada por un número de factores que incluyen 1) la falta de una correlación in vitro, 2) la dificultad en la generación de grandes cohortes de ratones con genotipos complejos, 3) de largo de latencia de pt el desarrollo tumoral situ , 4) y estocástico progresión del tumor. Debido a la tumorigénesis in situ carece de un modelo correspondiente in vitro, las pruebas de drogas in vitro no se puede realizar wmodelos condicionales Ith GEM. En contraste con otros tipos de cáncer, los modelos condicionales de GEM astrocitomas rara vez son inducidos por mutaciones oncogénicas individuales ^11. Por lo tanto, se requieren complejos sistemas de mejoramiento para generar GEM condicional con múltiples mutaciones oncogénicas. Por otra parte, la iniciación astrocitoma ocurre con penetrancia variable después de un largo período de latencia en estos modelos, mientras que la progresión a los astrocitomas de alto grado se produce generalmente en un no-uniforme, de manera estocástica y en última instancia da lugar a tumores con complejos paisajes genómicas y la cinética de crecimiento rápido ^{27, 28.} La penetrancia variable y la naturaleza estocástica de la progresión maligna en modelos GEM condicional requiere que los ratones individuales se seleccionaron mediante imágenes radiográficas para detectar la presencia y la ubicación de los astrocitomas de alto grado antes de su inscripción en los ensayos de medicamentos preclínicos. Tomados en conjunto, estas limitaciones impiden la generación y prueba de los grandes cohortes de GEM condicional requerida para prpruebas de drogas eClinical.

El sistema de GEM RCAS-TVA, que utiliza retrovirales aviar (RCAS) vectores para infectar GEM ingeniería genética para expresar el receptor viral (TVA) en tipos específicos de células neuronales, se ha utilizado ampliamente para modelar la tumorigénesis astrocitoma ^11. En contraste con GEM condicional, este modelo de sistema permite la introducción de múltiples mutaciones oncogénicas en tipos de células específicas sin el requisito de que los esquemas de selección complejas. Sin embargo, está limitada por penetrancia variable, el requisito de que las células se dividen activamente para lograr la integración viral, y la inserción aleatoria de transgenes en el genoma huésped ^29.

Los modelos no germinales GEM (nGEM), que utilizan células recogidas de GEM, son cada vez más importantes, ya que superar muchas de las limitaciones de otros sistemas modelo ^15. El papel de tipo de célula y de iniciar mutaciones concurrentes en la patogénesis astrocitoma son difíciles de disuadirmina utilizando establecido líneas de células humanas o GBM PDX porque se derivan de los tumores en etapa terminal que se han acumulado mutaciones genéticas extensas en tipos de células no definidos durante el curso de la progresión maligna. En contraste, todos los grados de astrocitomas pueden modelarse usando nGEM mediante la inducción de mutaciones genéticas definidas dentro de los tipos de células cerebrales purificados específicos ^11,30. Por lo tanto, la influencia de mutaciones genéticas específicas y tipo de células en fenotipos celulares y moleculares se puede determinar in vitro e in vivo. Similar a las líneas de células de GBM humanos establecidos, pt ensayos in vitro inicial de fármaco usando nGEM se puede utilizar para priorizar los medicamentos para las pruebas in vivo utilizando las mismas células. La tumorigénesis in vivo, se puede determinar por aloinjerto nGEM células ortotópicamente en los cerebros de los compañeros de camada singénicos inmunocompetentes ^30. Por tanto, estos modelos de aloinjertos ortotópico permiten pruebas in vivo no sólo de citotóxica convencional unnd terapias dirigidas, pero inmunomoduladores y terapias estroma orientada también. Finalmente, el papel del microambiente en la iniciación y progresión del tumor se puede determinar mediante la comparación de resultados entre los modelos convencionales GEM nGEM y utilizando las mismas mutaciones en los mismos tipos de células.

Nosotros y otros han desarrollado astrocitoma nGEM utilizando células primarias – astrocitos, NSC, o células precursoras de oligodendrocitos (OPC) – recogidas de GEM ^30-34. La razón de ser del desarrollo de un astrocitoma nGEM era crear un modelo para determinar las consecuencias fenotípicas de las mutaciones oncogénicas en tipos específicos de células que podrían ser utilizados para las pruebas de drogas preclínicas in vitro e in vivo en animales inmunocompetentes. Cosechamos astrocitos fenotípicamente WT corticales y NSC de la no-Cre que expresan, GEM condicional mantenido en un> 94% de fondo C57 / Bl6 con vía presupuesto ordinario floxed – Rb1 ^{loxP / loxP,} o TgGZT121 – y floxed RTK / RAS / PI3K vía – Cf1 ^{loxP / loxP,} Kras ^G12D, PTEN ^{loxP / loxP} – genes en varias combinaciones ^35-39. Inducimos recombinación genética in vitro usando vectores adenovirales que codifican la recombinasa Cre. Debido a que las cosechas de astrocitos corticales contienen una mezcla de tipos de células, hemos utilizado vectores Ad5GFAPCre o transgenes oncogénicos dominantes, tales como TgGZT ₁₂₁ impulsada desde el promotor GFAP humana, para enriquecer para GFAP ⁺ astrocitos corticales en estos cultivos. Hemos definido las consecuencias fenotípicas de G ₁ / S (Rb), MAPK, y mutaciones de la vía PI3K en astrocitos corticales y NSC in vitro e in vivo. MAPK y PI3K vía activada por G1 / S-defectuosos astrocitos molecularmente mimetizada GBM humano proneural y, tras la inyección ortotópico, tumores formados en una ubicación predefinida con una cinética de crecimiento uniforme, latencias cortas, y el histopatológicosAL características de GBM humano ^30. Monitoreo longitudinal del crecimiento del tumor in vivo ayuda a las pruebas preclínicas fármaco a través de la normalización de las cohortes de tratamiento y análisis cuantitativo de crecimiento del tumor en respuesta al tratamiento ^40. Se determinó la cinética de crecimiento del tumor por imágenes de bioluminiscencia longitudinal de los ratones inyectados con luciferasa que expresa astrocitos corticales. Por lo tanto, los astrocitos corticales y NSC derivados de GEM condicional proporcionan un sistema modelo manejable para la definición de las consecuencias funcionales de las mutaciones de astrocitoma asociada y un sistema de modelo potencial para el desarrollo de fármacos preclínicos.

Protocol

Todos los estudios con animales fueron aprobados por la Universidad de Carolina del Norte Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión. 1. cultivo cortical astrocitos de ratones recién nacidos Preparación Arruga 2-3 tejidos de tareas delicadas y colocar en el fondo de un matraz que contiene 70% de etanol. Coloque tijeras de disección, fórceps curvos y 2 pares de pinzas de micro directamente en este frasco. Los tejidos se utilizan para evitar que se doblen l…

Representative Results

Hemos desarrollado un sistema modelo nGEM con astrocitos corticales y NSC cosechadas de acogida GEM neonatal floxed alelos oncogénicos condicionales que se pueden caracterizar fenotípicamente in vitro e in vivo (Figura 1). Con el fin de investigar las consecuencias de mutaciones oncogénicas específicamente en astrocitos corticales in vitro, es crítico para enriquecer primero para astrocitos. Cosechas de astrocitos corticales contienen una mezcla de microglia, astrocitos, …

Discussion

Los pasos más importantes para garantizar la cosecha y cultivo de astrocitos corticales son 1) adecuado para extirpar la corteza sin tomar tejido debajo del cuerpo calloso, 2) para eliminar las meninges, 3) para disociar completamente las células, y 4) para enriquecer para GFAP ⁺ astrocitos. Aunque hemos utilizado mecánica (agitación) y genéticas (restricción de la recombinación genética con un vector de Ad5GFAPCre o la utilización de un transgén transformadora dominante (TgGZT ₁₂₁₎</…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)	Invitrogen	11995065	DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro
Fetal Bovine Serum, Regular	Cellgro	35-010-CV
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher Scientific	08-395
Cartilage Thumb Forceps, Curved	Fisher Scientific	1631
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4	Miltex	17-301
Ethanol (200 proof)	Decon Labs	2710
Razor Blades	VWR	55411-050
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid	Invitrogen	14175-095
TrypLE Express (1X), Phenol Red	Invitrogen	12605-010	Other Trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture
CULTURE DISH, 60 x 15 mm	Thomas Scientific	9380H77
15 ml tubes	BD Biosciences	352096
50 ml tubes	BD Biosciences	352070
Adenovirus stock	Gene Transfer Vector Core, U. Iowa	Ad5CMVCre	Store in 5 µl aliquots at -80 C. Hazardous.  Use Bsl2 safetyy  precautions
Sodium sulfate (Na2SO4)	Sigma-Aldrich	238597
Potassium sulfate (K2SO4)	Sigma-Aldrich	221325
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	746495
HEPES potassium salt	Sigma-Aldrich	H0527
D-(+)- Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Phenol Red	Sigma-Aldrich	P3532
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881
Papain	Worthington	LS003127
L-Cysteine-HCl	Sigma-Aldrich	C1276
Syringe filter (0.22 µm pore size)	Millipore	SLGP033NS
Neurocult proliferation kit, mouse	Stemcell Technologies	5702	This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture
0.2% Heparin solution	Stemcell Technologies	7980
EGF	Invitrogen	PMG8041
bFGF	Invitrogen	PHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10X)	Invitrogen	14185-052
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
E-64	Sigma-Aldrich	E3132	Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C
6-well plates	Fisher Scientific	07-200-83
Cell strainer (40 µm pore size)	Corning	352340
Stem cell dissociation solution	Stemcell Technologies	5707	Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase
Methyl cellulose 15 cP	Sigma-Aldrich	M7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2X	Millipore	SLM-202-B	For making 5% methyl cellulose solution
1.7mL Snap Cap Microcentrifuge Tube	Corning	3620
Hamilton syringe, 250 µl LT no needle	Fisher Scientific	14-815-92
PB600-1 Antigen Dispenser	Hamilton	83700
Disposable 18 ga needles	Fisher Scientific	NC9015638
27 ga 1/2" luer tip needle	Fisher Scientific	14-826-48
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402
Betadine	Fisher Scientific	NC9386574
Puralube Opthalmic Ointment	Fisher Scientific	NC9689910
Model 900 Stereotaxic frame	Kopf Instruments
VETBOND	Fisher Scientific	NC9259532	Tissue adhesive
Lidocaine	ShopMedVet	RXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G3580
Anti-Sox2	Millipore	AB5603
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako	Z0334
IVIS Kinetic	PerkinElmer		For in vivo imaging
D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate	PerkinElmer	122796	For in vivo bioluminescence imaging
EdU Imaging Kit	Invitrogen	C10340
MSCV Luciferase PGK-hygro	Addgene	18782